鮭魚皮明膠的提取及膠原蛋白肽的制備

孔 惠， 邢曉平， 曹玉華*， 曹光群

（1.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫214122；2.鹽城工學院 化學與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

膠原蛋白作為細胞外基質的重要組成部分，是哺乳動物體內含量最豐富、分布最廣的蛋白質[1-3]。明膠是以膠原蛋白為原料，通過不可逆轉的熱變性部分水解得到的一種可溶性蛋白質[4]，相對分子質量分布在幾萬至幾百萬之間，不能被人體直接吸收。膠原蛋白肽作為膠原蛋白或明膠的酶解產物，相對分子質量低于10 000，具有特殊的生理活性，尤其以小分子的膠原蛋白肽更易被人體吸收。

市面上的膠原蛋白產品多從豬和牛的皮、骨中提取[5]。近年來海洋生物膠原蛋白的開發受到廣泛關注，深海魚類膠原蛋白最易被人體吸收[6]。魚類加工過程中產生大量廢棄物，如魚皮、魚鱗和鰭，可成為新的膠原蛋白資源，既降低了生產成本，又減少了環境污染[7]。而魚皮中膠原含量比其它部位高很多，最高可超過其蛋白質總量的80%[8-9]。近年來，平鰭旗魚[10]、阿拉斯加鱈魚[11]、海鰻[12]、紅鰭東方鲀[13]等海洋魚類的魚皮相繼被用來提取膠原蛋白。

鮭魚被稱為“水中至尊”，魚皮中存在大量膠原蛋白，作者以鮭魚皮為原料提取明膠，進一步采用木瓜蛋白酶酶解明膠制備低相對分子質量膠原蛋白肽，并通過單因素實驗及正交試驗對酶解工藝進行優化[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干鮭魚皮：北海斯麥兒貿易有限公司產品；木瓜蛋白酶（酶活1.23×105U/g生化試劑）：上海藍季科技發展有限公司產品；其余試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司產品。

Free-Zone型真空冷凍干燥機：美國LABCONCO公司產品；TU-1901型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司產品；高效液相色譜Agilent 1100：美國安捷倫公司產品；高效液相色譜Waters1525及紫外檢測器 Waters2487：美國Waters公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚皮前處理 干鮭魚皮切成0.4 cm×0.4 cm碎塊，清洗，0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，水洗至中性，正己烷浸泡24 h，去離子水沖洗干凈。

1.2.2 明膠的提取及純化 參考文獻[15]，稍作改動。取適量處理后的鮭魚皮，加入6倍體積質量分數為0.2%的H2SO4以200 r/min的轉速攪拌40 min，去離子水沖洗至中性，再加入6倍體積質量分數為1.0%的 檸檬酸同一轉速攪拌40 min，去離子水沖洗至中性，最后加入10倍體積去離子水，45℃恒溫水浴攪拌過夜，先用2層紗布過濾，再將濾液以6 000 r/min離心20 min。上層清液中加入NaCl鹽析48 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀溶于0.5 mol/L醋酸溶液中，0.1 mol/L醋酸溶液透析24 h，再用去離子水透析48 h，每12 h換一次透析液，真空冷凍干燥后得到純度較高的鮭魚皮明膠。

1.2.3 明膠質量分數的測定 根據GB/T 9695.23-2008[16]，采用分光光度法，通過測定樣品中羥脯氨酸質量分數，將羥脯氨酸含量乘以系數11.1[17]，即得到原料鮭魚皮中明膠的質量分數。

1.2.4 紫外光譜掃描 將明膠樣品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配成1 mg/mL溶液，在190～400 nm波長范圍內進行掃描。

1.2.5 氨基酸組成分析 稱120 mg明膠，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，真空封管，110℃水解22 h，水解液定容，過濾，移取1 mL濾液放入真空干燥器內過夜干燥。加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶液，靜置1 h后，10 000 r/min離心10 min，取0.4 mL上清液進行氨基酸組成分析。

1.2.6 木瓜蛋白酶水解明膠的單因素實驗 酶解初始條件為底物濃質量分數8%，加酶量5%，溫度55℃，pH 7.0，水解時間2.5 h。水解過程中采用pH-stat法測定酶解液的水解度[18]，通過加入已知濃度的NaOH溶液保持酶解液pH不變，記錄堿消耗量，計算水解度（DH）[19]。

1.2.7 膠原蛋白肽制備的正交實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，以水解度為指標，按照L9（34）正交實驗表綜合考慮蛋白酶最適pH、最適溫度、加酶量以及底物質量分數對膠原蛋白水解度的影響，結果見表1。

表1 正交實驗設計因素水平表Table1 Levelsand factorsoforthogonaldesigned experiments

1.2.8 相對分子質量分布 將上述制備的明膠和肽溶于超純水中，得到質量濃度1 mg/mL的試液，過膜。分析儀器：Waters 1525；色譜柱 TSK-gel G2000SWXL，流動相：V（三氟乙酸）∶V（乙腈）∶（水）=0.1∶40∶60；流量：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。檢測波長220 nm。

2 結果與討論

2.1 明膠提取率及純度分析

由分光光度法得到羥脯氨酸回歸方程：

A=0.190 1C-0.011 8

式中：A為吸光值；C為羥脯氨酸質量分數；相關系數為R2=0.995 8，相關性良好。由此得到鮭魚皮中羥脯氨酸質量分數為4.19%，乘以換算系數11.1，得到鮭魚皮中明膠總質量分數為46.51%。粗提物得率為28.12%，明膠提取率為60.46%。粗明膠中羥脯氨酸質量分數為7.56%，由此得明膠質量分數為83.92%。

2.2 紫外光譜分析

蛋白質分子含有能夠吸收某一波長光的紫外生色基團，各種紫外生色基團的加和使蛋白質分子有一定的紫外吸收[20]。由圖1可見，得到的鮭魚魚皮提取液的紫外最大吸收峰在233 nm，符合明膠的紫外吸收特征，主要是肽鍵C=O電子n→π*和n→σ*躍遷產生的強吸收。鮑士寶等研究鮰魚皮膠原蛋白的紫外最大吸收峰為233 nm[21]，與作者提取得到的明膠紫外最大吸收峰結果相似。而芳香族氨基酸色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）中含有共軛雙鍵，其中Trp和Tyr在280 nm附近有紫外吸收，Phe在257 nm處有紫外吸收[22]，而Trp在280 nm處的紫外吸收最強，但明膠中幾乎不含Trp，所以在280 nm處無強吸收峰。本實驗中的明膠在250～280 nm處有極弱的紫外吸收峰，說明含有少量的Phe等芳香族氨基酸，與表2中氨基酸分析結果一致。因此，紫外吸收光譜表明經酸浸-水提法得到純度較高的鮭魚皮明膠。

圖1 鮭魚皮明膠紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of the gelatin from salmon skin

表2 鮭魚皮明膠的常規氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of gelatin from salmon skin

2.3 氨基酸組分分析

明膠的氨基酸組成有其特點，甘氨酸約占氨基酸總質量的30%，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較高，其中脯氨酸約占氨基酸總質量的10%，而羥脯氨酸作為明膠的特征氨基酸含量較高，并且明膠不含或含極少量的半胱氨酸和色氨酸，對于絕大多數的蛋白質而言，脯氨酸的質量分數相對較少，目前只有膠原蛋白的脯氨酸質量分數超過10%[23]。

表2中列出了鮭魚皮明膠的氨基酸質量分數，甘氨酸質量分數最高，為34.4%，其次為丙氨酸和脯氨酸，質量分數分別為13.01%、11.57%，亞氨基酸總含量為16.67%，甘氨酸和亞氨基酸質量分數約占總氨基酸的50%。芳香族氨基酸及含硫氨基酸質量分數極少。因此，通過對表2中氨基酸組成的分析可知，實驗得到的是純度較高的鮭魚皮明膠。宋芹等[24]研究羅非魚皮膠原蛋白中甘氨酸質量分數最高，為32.28%，丙氨酸及脯氨酸質量分數分別為12.36%、11.74%，羥脯氨酸質量分數為8.17%，與鮭魚皮明膠相比略有差異。

2.4 木瓜蛋白酶水解明膠的單因素實驗

作者考察了酶解時間、底物質量分數、加酶量、pH、溫度對木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠反應的影響。

由圖2（a）可知，反應一開始，水解度隨時間變化很快。1 h后，水解速度減慢，水解度變化也趨于平緩。2.5 h后，水解度幾乎不隨時間的變化而變化，水解反應及其緩慢，故水解時間選定為2.5 h。

由圖2（b）可以看出，底物濃度與水解度呈正相關性，當底物質量分數為8%時達到最大值，當底物質量分數大于8%時，水解度呈下降趨勢。這是因為，底物質量分數低會降低底物與酶分子結合機率，影響酶促反應的速率，底物濃度增大使得酶作用點增加，水解度增大。而繼續增大底物質量分數，使得水解液過于黏稠，酶無法在水解液中完全擴散，酶解效率降低，水解度下降。所以底物質量分數選定為8%。

由圖2（c）可以看出，加酶量增大，水解度隨之增大，當加酶量為質量分數7%時，酶解速度開始變慢。因為酶具有專一性，只能打開相應位點上的肽鍵，當加酶量繼續增加，所有肽鍵均被打開后，水解度基本不會再變化。所以加酶量選定為質量分數7%。

由圖2（d）可知，pH作為酶解反應的主要因素，水解度隨著pH值的增大而增大，當pH為8.0時水解度最大，繼續增大pH，水解度呈現下降的趨勢。主要是因為pH過高或過低都可能使酶分子變性。另外，在酶解反應過程中，酶解液pH的變化會影響酶的活性部位及其附近的解離基團與底物的結合，同時底物的解離也受pH變化的影響，因此確定適宜pH值為8.0。

溫度是影響酶解反應的主要因素。由圖2（e）可知，溫度與水解度也呈正相關性，水解溫度達到55℃時，水解度最大，此后繼續升高溫度，水解度開始降低。這是因為低溫使酶與底物的碰撞機率降低，高溫使酶失去活性。所以水解溫度選定為55℃。

由單因素實驗得到木瓜蛋白酶水解鮭魚皮膠原蛋白的最優條件為：酶解時間2.5 h、底物質量分數 8%、酶質量分數 7%（8 610 U/g）、pH 8.0、溫度55℃，該條件下水解度為12.27%。

2.5 正交試驗結果與分析

由表3分析可知，各因素對木瓜蛋白酶水解明膠制備膠原蛋白肽水解率的影響次序為 A＞C＞D＞B，即加酶量＞酶解溫度＞pH＞底物質量分數。通過極差分析得到最優水平為A2B3C3D3，即酶解時間2.5 h，加酶量7%，底物質量分數 10%，酶解溫度60℃，pH8.5。而根據水解度數據分析得到較優的組合為A2B3C2D2。以上2種水平組合分別進行3次平行實驗，平均水解度分別為12.53%和12.65%。水解度較高的是A2B3C2D2，即酶解時間2.5 h，加酶量7%，底物質量分數10%，酶解溫度55℃，pH 8.0。

圖2 木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠的單因素實驗Fig.2 Optimization of reaction conditions of enzyme hydrolysis of gelatin from salmon skin

表3 鮭魚皮明膠酶解反應正交實驗分析Table 3 Orthogonalarray experimentalresults of enzymatic hydrolysis reaction of gelatin from salmon skin

2.6 魚皮膠原蛋白肽相對分子質量分布

圖3和表4反映了酸浸-水提法提取的鮭魚皮明膠相對分子質量情況，相對分子質量大于10 000的占96.7%，主要集中在25 000，還有少部分成為游離氨基酸。圖4和表5反映了木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠得到的膠原蛋白肽的相對分子質量分布情況，相對分子質量在3 000以下的占99.73%，并且主要集中在1 000以下，約占91.5%。

圖3 鮭魚皮明膠相對分子質量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution profile of gelatins from salmon skin

圖4 鮭魚皮膠原蛋白肽相對分子質量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution profile of collagen peptides from salmon skin

表4 鮭魚皮明膠的相對分子質量分布Table 4 Molecular range of gelatin from salmon skin

3 結語

以鮭魚皮為原料通過酸浸-熱水抽提法提取得到明膠，提取率為60.46%，明膠純度為83.92%。經紫外光譜掃描確定最大吸收波長為233 nm，并通過氨基酸分析進一步確定提取物為純度較高的明膠，符合明膠的理化特征。選用木瓜蛋白酶對明膠進行水解，并通過單因素實驗及正交實驗優化實驗條件，確定最優酶解條件為：水解時間2.5 h，加酶量7%，底物質量分數10%，酶解溫度55℃，pH8.0，該條件下水解度為12.65%。制備的膠原蛋白肽相對分子質量主要集中在1 000以下，占到91.5%，屬小相對分子質量膠原蛋白肽。