L-蘋果酸降解菌釀酒酵母降酸功能影響因素分析

王 英， 周劍忠， 夏秀東， 胡彥新， 李 瑩， 黃自蘇

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京210014）

有機(jī)酸是果酒組分之一，也是主要風(fēng)味物質(zhì)的主要組成成分，主要包括酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等，其中蘋果酸含量過(guò)高會(huì)使果酒有酸澀感，酒味粗硬。如何降低果酒中的蘋果酸含量一直是果酒釀造中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。物理降酸法、化學(xué)降酸法和生物降酸法是目前果酒產(chǎn)業(yè)中的主要降酸方法，但物理和化學(xué)降酸方法對(duì)果酒的風(fēng)味影響較大。利用乳酸菌或酵母菌生長(zhǎng)代謝降酸成為近年來(lái)果酒降酸的主要研究方向[1-4]。

果酒生物降解蘋果酸的途徑主要為蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malo-lactic Fermentation，MLF）和蘋果酸-酒精發(fā)酵（Malo-alcoholic Fermentation，MAF）。MLF主要利用乳酸菌將葡萄酒中的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，其特點(diǎn)是有選擇性的降酸，并且是在酒精發(fā)酵之后進(jìn)行[5-8]。MAF是通過(guò)裂殖酵母利用糖作底物生成酒精外，還能在厭氧條件下分解蘋果酸，最終生成乙醇和CO2，但是裂殖酵母發(fā)酵能力較弱，且會(huì)使果酒產(chǎn)生不良?xì)馕禰9]。目前，有研究者從自然發(fā)酵的果酒中篩選具有優(yōu)良降解L-蘋果酸功能又具有優(yōu)良發(fā)酵性能的釀酒酵母，在果酒發(fā)酵的過(guò)程中使酒精發(fā)酵和降酸同時(shí)進(jìn)行，達(dá)到簡(jiǎn)化果酒發(fā)酵工藝[4，10-12]。

大量的研究結(jié)果表明，環(huán)境因素（時(shí)間、底物濃度、接種量等）對(duì)微生物的功能特性的發(fā)揮有很大的影響[13-15]。為了更好的發(fā)揮微生物的功能，研究者利用正交設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面、中心組合設(shè)計(jì)等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)影響微生物功能特性的條件進(jìn)行優(yōu)化，為充分發(fā)揮菌株的功能特性提供指導(dǎo)[16-18]。

作者以實(shí)驗(yàn)室保存的具有降L-蘋果酸功能的釀酒酵母菌株FM-S-115為研究對(duì)象，研究溫度、接種量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2質(zhì)量濃度等因素對(duì)FM-S-115菌株降酸能力的影響，并利用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)該菌株的降酸條件進(jìn)行優(yōu)化，確立FM-S-115菌株的最佳降酸條件，為FM-S-115菌株在果酒生產(chǎn)中應(yīng)用提供技術(shù)支持，同時(shí)為果酒的生物降酸提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

降酸酵母FM-S-115，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存保藏。

1.2 試劑與設(shè)備

甲醇（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸（分析純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，切成小塊加水至1 L，煮沸1 h，雙層紗布過(guò)濾，補(bǔ)水至1 L，加入20 g葡萄糖；固體培養(yǎng)基：添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂。

LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海恒科技有限公司產(chǎn)品；THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫震蕩機(jī)：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；SevenEasy plus pH儀：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；超級(jí)水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；LC2030型高效液相色譜儀：北京安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備 在PDA液體培養(yǎng)基中接種菌株FM-S-115，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，用新鮮的PDA培養(yǎng)液洗滌2次后重懸，調(diào)整A600nm值為2.10～2.15，作為L(zhǎng)-蘋果酸降解試驗(yàn)的接種菌液。

1.3.2 降酸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 黑莓經(jīng)打漿酶解后，5 000 r/min離心10 min， 上清液用依次用0.8 μm 和0.22 μm的無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾。以含有體積分?jǐn)?shù)50%的無(wú)菌黑莓清汁和50%的PDA液體培養(yǎng)基的混合液體為測(cè)定菌株FM-S-115降酸性能的培養(yǎng)液體，加入無(wú)菌的L-蘋果酸溶液，使體系中L-蘋果酸終質(zhì)量濃度為4 g/L，除非特別說(shuō)明，接種量為體積分?jǐn)?shù)4%，培養(yǎng)溫度為28℃，100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為9 d，HPLC檢測(cè)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 樣品處理 發(fā)酵液樣品經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清，用雙蒸水稀釋合適倍數(shù)后經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.3.4 L-蘋果酸質(zhì)量濃度的檢測(cè) 色譜條件色譜柱：Atlantis C18 柱 （46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（0.01 mol/L 緩沖溶液 KHPO4）=3∶97，pH 2.8；流量：0.7 mL/min；進(jìn)樣體積 20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：室溫。

式中：C0為降解前蘋果酸（檸檬酸）的質(zhì)量濃度；C1為降解后蘋果酸（檸檬酸）的質(zhì)量濃度。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn) 主要考慮發(fā)酵溫度、接種量、SO2質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為菌株FM-S-115的降酸能力的影響因素，在各因素試驗(yàn)中采用1.3.2和1.3.3所述的方法進(jìn)行樣品處理和蘋果酸濃度的檢測(cè)。

1.3.6 FM-S-115降酸條件優(yōu)化 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)結(jié)合果酒釀造過(guò)程中的可調(diào)控條件，選取接種量、培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度為3個(gè)主要因素，在蘋果酸質(zhì)量濃度為4 g/L的黑莓汁和PDA混合液體培養(yǎng)基中，100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d，在利用中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）軟件生成響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案，具體內(nèi)容見表1。預(yù)測(cè)FM-S-115降酸條件的最優(yōu)條件組合。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Codes and levels of the test

1.3.7 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證 按照獲得的二次回歸方程所預(yù)測(cè)的最佳組分配比條件進(jìn)行降酸，通過(guò)搖瓶發(fā)酵降酸試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的有效性。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2010軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，用Design-expert 8.0.5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)FM-S-115的降酸率影響

溫度是影響菌體生長(zhǎng)的主要因素之一，同時(shí)也是影響菌株功能特性的主要因素。培養(yǎng)溫度在20～32℃范圍內(nèi)，菌株FM-S-115對(duì)L-蘋果酸的降解能力隨發(fā)酵溫度的增加其降酸能力不斷增加，在26℃時(shí)，菌株FM-S-115的降酸能力最強(qiáng)，降酸率達(dá)29.81%。之后隨著溫度的增加，其降酸能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于在適宜菌體生長(zhǎng)的溫度條件下，菌體密度高，相應(yīng)的菌體的降酸功能就會(huì)增加。綜上所述，發(fā)酵時(shí)間控制在26℃左右，F(xiàn)M-S-115菌株的降酸能力較好。

2.2 接種量對(duì)蘋果酸降解率的影響

菌體接種量的變化直接影響著菌體的生長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)菌體接種量過(guò)低時(shí)，菌體的適應(yīng)性降低，相應(yīng)的延滯生長(zhǎng)期就會(huì)延長(zhǎng)，但菌體的接種量過(guò)大，菌體會(huì)很快進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，消耗大量的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求，影響菌體的生長(zhǎng)。

2.3 SO2質(zhì)量濃度對(duì)FM-S-115降酸率的影響

由于SO2具有抗氧化和抑制微生物的生長(zhǎng)的功能，因此在果酒的發(fā)酵過(guò)程中，常被用來(lái)作為抑菌劑和護(hù)色劑使用[19-20]。因此，作者對(duì)SO2質(zhì)量濃度變化對(duì)菌株FM-S-115的降酸特性的影響進(jìn)行了分析。菌株FM-S-115對(duì)L-蘋果酸的降解能力隨SO2質(zhì)量濃度的變化而變化，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度在0～80 mg/L范圍內(nèi)，菌株FM-S-115的降酸能力隨SO2質(zhì)量濃度的增加而增加；SO2質(zhì)量濃度大于80 mg/L時(shí)，菌株的降酸能力隨SO2質(zhì)量濃度的增加而減小。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)FM-S-115降酸率的影響

在果酒的釀造過(guò)程中，前期菌落結(jié)構(gòu)組成豐富，具有多種多樣的酵母類群，如漢森酵母（Hanseniaspora）、畢赤酵母 （Pichia）、 假絲酵母（Candida）、接合酵母（Zygosaccharomyces）等，但在發(fā)酵后期，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是主要成員，因其對(duì)酒精具有較高的耐受性[21-22]。菌株FM-S-115對(duì)L-蘋果酸的降解能力隨酒精體積分?jǐn)?shù)的變化而變化，體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于10%時(shí)，菌株的降酸能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸減小，但是降低不顯著（P＞0.05）；此結(jié)果表明，菌株FM-S-115對(duì)酒精具有較高的耐受性，并且低濃度的酒精對(duì)該菌株的其降酸功能影響不大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在大于10%，降酸能力急劇下降。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FM-S-115降酸率的影響

菌株FM-S-115對(duì)L-蘋果酸的降解能力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其降酸率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在發(fā)酵初期，降酸率增加比較明顯，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，降酸率增加幅度逐漸呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。

2.6 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)FM-S-115降酸率的影響

適當(dāng)?shù)脑黾犹荚礉舛龋欣诰w的生長(zhǎng)，但體系中碳源濃度過(guò)高時(shí)，體系的滲透壓增大，高的滲透壓對(duì)菌體生長(zhǎng)會(huì)有不同的抑制作用。體系中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株FM-S-115的降酸能力隨著體系中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

2.7 FM-S-115降酸條件的優(yōu)化

根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合在果酒釀造中可操控的實(shí)驗(yàn)因素，對(duì)接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和SO2質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行了3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到菌株FM-S-115降酸率預(yù)測(cè)值（Y）對(duì)編碼自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程：

式中，Y為菌株的降酸率的預(yù)測(cè)值；A、B、C為3個(gè)自變量的編碼值。

從回歸模型方差分析結(jié)果可知，該模型的F值為52.69，P＜0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著；且失擬項(xiàng)的F值為1.49，P值為0.337 0，大于0.05，說(shuō)明方程具有良好的擬合性和實(shí)用性，實(shí)驗(yàn)誤差較小。另外，該模型的矯正系數(shù)R2Adj=0.960 8，說(shuō)明該模型能解釋96.08%的菌株FM-S-115降酸率的變化。從模型中可以看出，根據(jù)各影響因素系數(shù)的絕對(duì)值大小可以得到各因素對(duì)FM-S-115菌株的降酸率的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞接種量＞SO2質(zhì)量濃度。由回歸方差分析可知，培養(yǎng)溫度、接種量和SO2質(zhì)量濃度對(duì)FM-S-115菌株的降酸率的影響都處于顯著水平。培養(yǎng)溫度和接種量存在顯著的交互作用，培養(yǎng)溫度與SO2質(zhì)量濃度存在顯著的交互作用，對(duì)FM-S-115菌株的降酸率影響較大。接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用不顯著。

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert軟件做出兩因子交互作用的響應(yīng)面及其等高線，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度和接種量、接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用分別見圖1～3。如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，表明處理?xiàng)l件的變化對(duì)響應(yīng)值較小，相反，響應(yīng)曲面的坡度陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感；等高線若為橢圓，說(shuō)明兩個(gè)因素交互作用明顯，等高線圖若為圓形，說(shuō)明兩者交互作用不明顯[23]。

圖1顯示了接種量為5%時(shí)，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度對(duì)菌株FM-S-115的降酸率的貢獻(xiàn)率相當(dāng)，從等高線圖中可以看出，培養(yǎng)溫度和SO2質(zhì)量濃度交互作用不顯著。圖2顯示了SO2質(zhì)量濃度為80mg/L時(shí)，接種量和發(fā)酵溫度對(duì)菌株FM-S-115的降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，接種量和發(fā)酵溫度對(duì)菌株FM-S-115的降酸率的貢獻(xiàn)率相當(dāng)，從等高線圖中，可以看出，接種量和發(fā)酵溫具有明顯的交互作用。圖3顯示了培養(yǎng)溫度為26℃時(shí)，SO2質(zhì)量濃度和接種量對(duì)菌株FM-S-115的降酸率的影響，從響應(yīng)曲面圖中可以看出，接種量對(duì)菌株FM-S-115的降酸率的貢獻(xiàn)率高于SO2質(zhì)量濃度，從等高線圖中，可以看出，接種量度和SO2質(zhì)量濃度具有顯著的交互作用作用。

圖1 SO2質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.2 Reciprocal effects of SO2concentrations and temperature on deacidification ratio of FM-S-115 strain

圖2 接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.2 Reciprocal effects of inoculation amounts and temperature on deacidification ratio of FM-S-115 strain

圖3 SO2質(zhì)量濃度和接種量對(duì)菌株FM-S-115降酸率的交互效應(yīng)Fig.3 Reciprocal effects of SO2concentrations and inoculation amount on deacidification ratio of FM-S-115 strain

由二次多項(xiàng)回歸方程得出3個(gè)因素的最佳值為溫度為26.26℃ 接種量為5.15%，SO2質(zhì)量濃度為81.08 mg/L，菌株FM-S-115的降酸率的預(yù)測(cè)值為37.98%。采用上述優(yōu)化后的條件，進(jìn)行驗(yàn)證，3次重復(fù)，結(jié)果顯示，F(xiàn)M-S-115的降酸率為38.11%，與預(yù)測(cè)值37.98%接近，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂刹僮餍愿摺?/p>

3 結(jié)語(yǔ)

作者通過(guò)對(duì)影響菌株FM-S-115降酸能力的因素進(jìn)行系統(tǒng)的研究，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵溫度和SO2質(zhì)量濃度為影響FMS-115降酸能力的3個(gè)主要因素，利用Central Composite Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立菌株FM-S-115降酸性能的優(yōu)化回歸數(shù)學(xué)模型，該模型在本實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)能很準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)顯示菌株FM-S-115的降酸能力。方差分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)FM-S-115菌株的降酸率的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞接種量＞SO2質(zhì)量濃度。另外，培養(yǎng)溫度、接種量和SO2質(zhì)量濃度對(duì)FM-S-115菌株的降酸率的影響都處于顯著水平。培養(yǎng)溫度和接種量存在顯著的交互作用，培養(yǎng)溫度與SO2質(zhì)量濃度存在顯著的交互作用，對(duì)FMS-115菌株降酸率的影響較大。接種量和SO2質(zhì)量濃度的交互作用不顯著。

最佳優(yōu)化條件為：接種量 （體積分?jǐn)?shù)）5.15%，SO2質(zhì)量濃度81.08 mg/L，培養(yǎng)溫度為26.26℃，菌株FM-S-115的降酸率的預(yù)測(cè)值為37.98%。通過(guò)實(shí)際實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)M-S-115的降酸率為38.11%，與預(yù)測(cè)值非常接近，回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)都證明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮侠硇院涂尚行浴?/p>