2種新煙堿類殺蟲劑對秀麗隱桿線蟲神經(jīng)毒性研究

何雪珠，李洪博，胡亞茹，劉馥雯，林森，陸強，林匡飛

華東理工大學資源與環(huán)境工程學院，國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室，上海 200237

新煙堿類殺蟲劑是目前全世界增長最快，使用最廣泛的內吸性殺蟲劑，自拜耳公司于1991年推出第一代吡蟲啉之后，一系列的新煙堿類殺蟲劑相繼投入市場[1]。新煙堿類殺蟲劑具有類似煙堿吡啶環(huán)的特征結構，具有高效、廣譜的殺蟲活性，與昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)后突觸乙酰膽堿受體(nAChRs)結合，阻斷中樞神經(jīng)正常傳導，進而導致昆蟲麻痹、死亡[2-3]。這類殺蟲劑具有持久性和水溶性的特性，既能在土壤中富集，又能遷移到水環(huán)境中[4]。全球水體和土壤環(huán)境中都有檢出的報道，同時還有其導致蜜蜂種群數(shù)量銳減及對水生生物大型溞、搖蚊、蜉蝣等負面影響的報道[5-7]，從而引起了人們對其導致非靶標生物潛在危害的關注[8]。目前，我國對于這類農(nóng)藥的生態(tài)毒性研究主要集中在蜜蜂等傳粉性昆蟲[9]，而對其他土壤非靶標生物的毒性作用卻知之甚少。因此，研究新煙堿類殺蟲劑對土壤非靶標生物的神經(jīng)毒性的影響，對于該殺蟲劑的安全應用具有重大意義。

秀麗隱桿線蟲(C.elegans)生活在土壤和間隙水中，具有生命周期短，便于實驗室培養(yǎng)，對外部環(huán)境變化敏感，全基因組已知等特點，是毒理學研究中推薦的模式生物。目前秀麗線蟲的運動行為、攝食行為、生殖水平、壽命等指標已廣泛運用于重金屬、納米材料和有機農(nóng)藥的毒性評價中[10-12]。秀麗線蟲的神經(jīng)結構相對簡單，但神經(jīng)細胞體系功能完整，控制神經(jīng)遞質產(chǎn)生、代謝和傳遞的基因具有高度保守性[13]，因此在神經(jīng)毒性效應評價的應用上具有很大潛力。

本研究將秀麗線蟲分別暴露于吡蟲啉和呋蟲胺農(nóng)藥24 h后，觀察其運動行為、攝食行為、乙酰膽堿酶活性，以及乙酰膽堿酶編碼基因(ace基因)和金屬硫蛋白基因(mtl基因)轉錄水平的變化，探討這2種新煙堿類殺蟲劑在環(huán)境濃度暴露下對秀麗線蟲的神經(jīng)毒性作用，從而為新煙堿類殺蟲劑的生態(tài)風險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 線蟲培養(yǎng)與同步化

實驗用秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)為N2 Bristol野生型，由國際線蟲種質中心(CaenorhabditisGenetics Center，CGC)贈送。秀麗線蟲置于涂布OP 50大腸桿菌并過夜培養(yǎng)的線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)上。配制新鮮的線蟲裂解液(質量分數(shù)1% NaClO和0.5 mol·L-1NaOH)裂解成熟期線蟲，獲取同步化蟲卵，20 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，對生長至L4期線蟲進行暴露。

1.2 供試藥劑及設備

試劑藥品：吡蟲啉(95%，源葉生物)；呋蟲胺(96%，麥克林)；BCA法蛋白含量測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)；乙酰膽堿酶活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)；RNAprep pure Micro Kit(天根生化科技(北京)有限公司)和FastQuant RT Kit (with gDNase)(天根生化科技(北京)有限公司)；SYBR Green Master Mix(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)；無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、次氯酸鈉等化學藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：SZM45B1型體視顯微鏡(舜宇光學科技(集團)有限公司)；TECAN GENios酶標儀(帝肯(上海)貿易有限公司)；LightCycler?480定量PCR儀(羅氏公司)。

1.3 殺蟲劑配制及染毒方法

吡蟲啉和呋蟲胺分別溶于酒精后，配制成100 mg·L-1的儲備液，用K-medium(0.032 mol·L-1KCl和0.051 mol·L-1NaCl，高溫滅菌)分別稀釋至濃度為1 μg·L-1, 10 μg·L-1, 100 μg·L-1, 1 mg·L-1, 10 mg·L-1，最終酒精體積分數(shù)為0.1%。

用K-medium將同步化培養(yǎng)到L4期的秀麗線蟲從培養(yǎng)基轉移至裝有染毒液的24孔板中，每種農(nóng)藥、每個濃度設置3個平行，20 ℃恒溫染毒24 h。收集染毒后的秀麗隱桿線蟲，用K-medium清洗3次用于后續(xù)指標測定。所有指標設置3次平行。空白對照組是含0.1%體積的酒精的K-medium溶液，與染毒液中溶劑保持一致。

1.4 運動行為及攝食行為指標

運動行為指標包括頭部擺動頻率和身體彎曲，參照已有的文獻報道方法[14]，在配備視頻捕捉設備的體式顯微鏡下錄像保存。測定方法如下：將線蟲轉移至滴有K-medium的未涂菌的光滑培養(yǎng)基上，記錄1 min內線蟲頭部擺動的次數(shù)作為頭部擺動頻率指標，線蟲頭部從一側擺回另一側后，再擺動回來定義為1次頭部擺動。將線蟲轉移至未涂菌的光滑培養(yǎng)基上，記錄1 min內線蟲身體彎曲的數(shù)目作為身體彎曲指標。線蟲相對于身體長軸上一個波長的移動定義為1次身體彎曲。每個處理組至少測定20條線蟲。

攝食行為通過測定線蟲食物(OP 50)的改變量來進行定量分析[15]。在570 nm波長下測定暴露前后菌液吸光度值的變化量(ΔOD)。暴露前，用染毒液置換培養(yǎng)OP 50的LB液體培養(yǎng)基，調節(jié)起始OD值到1.0，將未染毒的L4期線蟲轉移至24孔板中進行染毒，于20 ℃恒溫、輕微振蕩24 h。各濃度分別設置一組不含線蟲的培養(yǎng)液作為對照組，以矯正大腸桿菌自身生長或死亡引起的吸光度值的變化。每一個暴露濃度重復3次。

1.5 乙酰膽堿酶活性

將染毒后的線蟲用K-medium沖洗收集到1.5 mL離心管中，在2.5 mL的Tris-EDTA緩沖液(pH 7.8)中低溫下勻漿，將勻漿粗提液在8 000 × g、4 ℃條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，每份粗酶液分別用BCA法蛋白含量測定試劑盒和乙酰膽堿酶活性測定試劑盒測定總蛋白含量和乙酰膽堿酶活性，每個樣品中的乙酰膽堿酶活性表達為單位質量蛋白中乙酰膽堿酶活性，以消除樣品之間生物量不同引起的差異。每個處理組的樣品重復3次。

1.6 基因表達定量分析

參照RNAprep pure Micro Kit和FastQuant RT Kit (with gDNase)說明手冊提取染毒后秀麗線蟲總RNA并逆轉錄合成cDNA。隨后，用熒光染料法在定量PCR儀進行定量PCR的實驗。用actin基因作為內參基因，選取基因引物序列如表1，并通過2-ΔΔCT法計算和分析目的基因[16]，公式為：

2-ΔΔCT=2-(ΔCT,q-ΔCT,cd)

其中，ΔCT=CT目的基因-CT內參基因；CT為循環(huán)次數(shù)，q代表處理組，cd代表對照組。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均通過空白組進行歸一化處理后用百分比表達，并采用平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。運用SPSS軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性差異為P<0.05和P<0.01。

2 結果(Results)

2.1 吡蟲啉和呋蟲胺對線蟲運動和攝食行為的影響

吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲運動行為和攝食行為的抑制如圖1所示。暴露24 h后，2種農(nóng)藥對秀麗線蟲運動行為和攝食行為的抑制作用隨著暴露濃度升高而增加。100 μg·L-1吡蟲啉暴露時，身體彎曲出現(xiàn)顯著抑制，呋蟲胺則達到10 mg·L-1才出現(xiàn)顯著抑制(P<0.01)。頭部擺動頻率比身體彎曲的指標更為敏感，在10 μg·L-1吡蟲啉暴露和100 μg·L-1呋蟲胺暴露后出現(xiàn)了顯著抑制(P<0.01)。攝食行為的敏感程度僅次于頭部擺動頻率，顯著的抑制作用出現(xiàn)在100 μg·L-1吡蟲啉暴露(P<0.01)和100 μg·L-1呋蟲胺暴露(P<0.05)，吡蟲啉和呋蟲胺對攝食水平的最大抑制率分別達到30.8%和36.4%，呋蟲胺顯示出更強的抑制作用。

2.2 吡蟲啉和呋蟲胺對線蟲乙酰膽堿酶活性的影響

吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲乙酰膽堿酶活性的抑制如圖2所示，秀麗線蟲在吡蟲啉和呋蟲胺暴露后，對乙酰膽堿酶的活性的抑制作用隨著濃度增加而增加。當吡蟲啉暴露濃度達到10 mg·L-1后，乙酰膽堿酶活性受到明顯抑制(P<0.05)，最高抑制率達到39.9%，而呋蟲胺暴露濃度從1 mg·L-1開始對線蟲的乙酰膽堿酶活性出現(xiàn)明顯抑制(P<0.01)，最大抑制率達到51.8%，呋蟲胺對線蟲乙酰膽堿酶活性的抑制作用更強。

表1 基因的引物序列Table 1 The primers of ace, mtl genes and actin gene of C. elegans

圖1 吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲運動行為和攝食行為的抑制注：* P<0.05，** P<0.01。Fig. 1 Locomotion behavior and feeding inhibition of C. elegans after exposed to imidacloprid and dinotefuranNote: *P<0.05, ** P<0.01.

2.3 吡蟲啉和呋蟲胺對線蟲相關基因表達的影響

吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲相關基因轉錄水平的影響如圖3所示。秀麗線蟲暴露于吡蟲啉和呋蟲胺后，乙酰膽堿酶編碼基因ace的表達水平都出現(xiàn)了不同程度的改變，ace-1、ace-3和ace-4基因出現(xiàn)表達上調，而ace-2基因出現(xiàn)表達下調，其中改變最大的是ace-1基因，在吡蟲啉暴露濃度為100 μg·L-1時，比對照組上調了6.30倍，而呋蟲胺暴露1 mg·L-1時，表達上調了6.11倍。吡蟲啉暴露后，mtl-1和mtl-2基因表達水平都有一定程度下調，而在呋蟲胺暴露后，mtl-1和mtl-2基因表達水平有部分上調。

圖2 吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲乙酰膽堿酶活性的抑制注：* P<0.05，** P<0.01；AchE的活性為相對活性。Fig. 2 Concentration response of the inhibitory effect on AChE activity in C. elegans exposed to imidacloprid and dinotefuranNote: *P<0.05, ** P<0.01; AchE activity is relative activity.

圖3 吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲相關基因轉錄水平的影響Fig. 3 Transcriptional response of related genes in C. elegans following exposure to imidacloprid and dinotefuran

3 討論(Discussion)

秀麗線蟲部分乙酰膽堿位點的亞基與攝食、運動和生殖具有一定的相關性[17]。Williams和Dusenbery[18]首次在評價農(nóng)藥時，引入了線蟲的運動行為作為指標，并發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷和敵敵畏對線蟲行為的阻滯效應。而攝食行為是在運動行為之后引入的對毒性敏感的指標[17]。因此，雖然這些指標并不是特定的神經(jīng)毒性，但是可以通過對神經(jīng)細胞的間接影響來解釋，并作為一個量化指標來評估農(nóng)藥的毒性[19]。吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲攝食和運動行為的抑制效應，間接反映了新煙堿類殺蟲劑對秀麗線蟲的神經(jīng)毒性作用。

新煙堿類殺蟲劑作為煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)激動劑與乙酰膽堿受體選擇性結合，與昆蟲乙酰膽堿(ACh)產(chǎn)生競爭，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導，導致昆蟲出現(xiàn)麻痹而死亡[3]。而乙酰膽堿酶(AChE)是水解乙酰膽堿的酶，可進而終止膽堿能突觸中的脈沖傳遞。在其他生物毒性試驗中，Azevedopereira等[7]發(fā)現(xiàn)96 h的吡蟲啉暴露導致了搖蚊(Chironomusriparius)AChE活性以及運動行為能力降低。Wang等[20]將赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)暴露于吡蟲啉14 d后發(fā)現(xiàn)了AChE活性降到最低值。秀麗線蟲在經(jīng)吡蟲啉和呋蟲胺暴露后乙酰膽堿酶活性均有隨著濃度增加而受到抑制。這反映了新煙堿類農(nóng)藥對秀麗線蟲有與靶標生物相似的作用機制，與乙酰膽堿位點結合導致秀麗線蟲生理指標上的異常。

吡蟲啉和呋蟲胺在各項生理指標中表現(xiàn)出不同程度的抑制效應。吡蟲啉和呋蟲胺殺蟲活性的結構不盡相同，在呋蟲胺出現(xiàn)以前，幾乎所有的新煙堿類化合物都有一個芳香雜環(huán)(吡蟲啉中的吡啶環(huán))，它被認為是殺蟲活性不可或缺的環(huán)，而呋蟲胺的殺蟲活性部位是它的四氫-3-呋喃甲基基團[21]。可能正是由于這種結構上的差異造成了乙酰膽堿結合位點的不同，也最終導致了吡蟲啉和呋蟲胺對秀麗線蟲各項生理指標的抑制程度的不同。

ace基因是編碼線蟲體內乙酰膽堿酶的基因，不同的ace基因表達共同調控線蟲體內乙酰膽堿酶的表達，但不同的ace基因在線蟲體內表達區(qū)域有一定的差異。研究表明，ace-1基因在所有外表皮細胞和陰泵肌肉細胞中有表達，ace-2基因表達主要在神經(jīng)元中，而ace-3和ace-4基因先在體內轉錄為雙順反子信使，從而構成操縱子，在咽肌細胞和2個神經(jīng)管相關神經(jīng)元中均有檢測[22]。暴露于新煙堿類殺蟲劑后，這4種ace基因的表達水平表現(xiàn)出了差異，ace-1、ace-3和ace-4基因分別都有上調，而ace-2基因表現(xiàn)為下調。但是不管是吡蟲啉暴露或者是呋蟲胺暴露之后，這種上調和下調卻是具有一致性，盡管這種影響程度也是有差異的。吡蟲啉暴露對ace-1基因的表達干擾程度更大，而其他基因受到呋蟲胺暴露的干擾程度更多。ace基因表達水平的變化也再次驗證了新煙堿類殺蟲劑對秀麗線蟲的神經(jīng)毒性。mtl是編碼硫蛋白的基因，Reichert和Menzel[23]在對5種外源性污染物引起的線蟲基因改變的研究中發(fā)現(xiàn)mtl基因是對環(huán)境變化十分敏感的基因，也是觀察線蟲通道中重要的基因，建議可作為線蟲對外源污染物評價的指示基因之一。mtl基因在低濃度的吡蟲啉和呋蟲胺暴露下都分別有明顯的表達變化，因此mtl基因表達水平可以作為新煙堿類殺蟲劑生態(tài)效應的生物標志物。

在本研究中，吡蟲啉和呋蟲胺從近環(huán)境濃度開始暴露，秀麗線蟲的運動行為和攝食行為、乙酰膽堿酶活性都受到一定程度的抑制，且具有濃度劑量效應關系，相關酶表達基因的轉錄水平也有所變化，顯示出新煙堿類殺蟲劑對秀麗線蟲的神經(jīng)毒性。基因表達比其他生理學指標都更為敏感，在環(huán)境濃度下也出現(xiàn)了明顯的改變。調控乙酰膽堿酶的ace基因轉錄水平的變化，影響了神經(jīng)遞質功能調節(jié)中起重要作用的乙酰膽堿酶，最終導致秀麗線蟲運動及攝食行為的改變。吡蟲啉和呋蟲胺暴露對秀麗線蟲表現(xiàn)出的神經(jīng)毒性，表明新煙堿類殺蟲劑對秀麗線蟲具有與對靶標生物相似的作用模式。但本研究選取的暴露濃度和時間是基于實驗室的評價，為了更好地評估新煙堿類農(nóng)藥對土壤非靶標生物的風險，仍需進一步研究低濃度長時間暴露下對秀麗線蟲的毒性效應。

致謝：在實驗探索過程中，感謝各位老師提供的指導和課題組同學們的幫助。