磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯對L-02肝細胞氧化應激及凋亡損傷機制

夏滬彬，陳超，李輝,*，張運超，王平，莊金龍，安澈，魯軍,#

1. 華東理工大學 資源與環境工程學院，上海 200237 2. 華東師范大學 上海市城市化生態過程與生態恢復重點實驗室，上海 200062 3. 華東理工大學 生物工程學院，上海 200237

隨著多溴聯苯醚(PBDEs)和六溴環十二烷(HBCD)的逐步禁用，作為新興的阻燃劑材料，有機磷酸酯阻燃劑(OPFRs)的使用頻率和用量大大增加[1]。據統計，我國有機磷阻燃劑在2007年產量達到了70 000噸，并且以15%速率持續增長[2]。磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)是最常見的一種有機磷酸酯阻燃劑，通過非化學鍵合的方式添加到各種使用材料中，在生產、消費的環節中，它們都可能釋放到水體、氣體和土壤環境介質中。TDCPP一般作為阻燃劑添加到聚氨酯泡沫、聚氯乙烯、聚酯纖維、環氧樹脂等材料中，這導致家庭紡織品、家具、裝修材料等成為室內阻燃劑重要污染源[3]，在對美國各州抽取的125戶室內氣體樣品檢測結果中發現，TDCPP檢出率達到100%，檢出平均濃度為2.021 mg·g-1[4]。隨著這些材料的廢棄、焚燒，TDCPP可能會進入到水體和室外空氣中，從中國的黃海、東海海域采集的水體樣本中檢測出TDCPP存在，均值濃度達到109.28 ng·g-1[5]，有研究報道表明OPFRs有很大一部分可能從大氣中通過降水或降雪進入土壤，學者在德國大學校園采集的土壤樣品中檢測到OPFRs，并且不同月份的土壤樣品中的OPFRs的含量差別較大，并且雨水和降雪中TDCPP濃度為46～100 ng·L-1，但在土壤中TDCPP的濃度低于檢出限，這可能和天氣條件有關[6]。環境介質中TDCPP廣泛存在，然后通過生物富集進入生物體，在瑞典深海湖中的鱸魚和中國南方珠江三角洲地區采集的淡水魚肌肉組織樣本檢測出TDCPP的存在，高達140 ng·g-1脂重和251 ng·g-1脂重[7]。研究表明甚至在代謝物、人體脂肪、精液以及母乳中有檢出[8]。

目前，國內外學者在TDCPP的毒理學方面已開展了一些研究，發現其具有內分泌干擾毒性、生殖發育毒性、神經毒性以及潛在致癌性[9-11]，但對肝毒性方面研究明顯不足。研究顯示，TDCPP可經皮和經口途徑進入生物體，并隨血液流動擴散到肺、肝臟以及腎臟等人體器官[12]。經TDCPP暴露后會影響大鼠肝臟，導致其臟器重量明顯增加，并且在慢性暴露實驗中，通過喂食含有一定濃度的TDCPP的飼料發現其可誘發小鼠腎臟、睪丸和肝臟等組織產生腫瘤[13]。Crump等[14]研究了TDCPP和TCPP對鳥類肝細胞的影響，結果表明肝細胞的外源化合物代謝、脂肪代謝易受TDCPP和TCPP暴露的影響，并且CYP3A37基因在培養的雞胚肝細胞中對TDCPP暴露具有高度敏感性。利用稀有鮈鯽探究TDCPP的毒性過程中發現，魚類肝臟組織中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶受到TDCPP的暴露影響，活性受抑制。在Sprague-Dawley大鼠的暴露實驗中發現，肝臟中代謝(細胞色素P450-3A1、CYP3A1)和甲狀腺激素(TH)清除(UGT1A6)相關基因的mRNA和蛋白表達水平有顯著依賴性增加，2個高劑量組中觀察到肝重量的顯著增加，并且肝細胞中TRβ、TTR、UGT1A6和CYP3A1的基因和蛋白表達受到明顯的影響[15]。以上報道中均發現TDCPP對動物肝臟能夠造成影響，但文獻中并未對其毒性作用及凋亡機制進行具體研究。且在動物和人體上存在種間上的差異。因此利用人體肝細胞為模型，研究其細胞和分子水平上TDCPP其對肝細胞毒性，不僅具有重要的學術理論價值，對于全面評價TDCPP的環境與人體健康風險具有重要的參考研究意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞系

人正常肝細胞HL-7702(L-02)細胞，由華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室惠贈。

1.2 實驗主要儀器與試劑

酶標儀(TECAN GENios, Switzerland)，熒光酶標儀(FLX800，BioTek公司，USA)，流式細胞儀(FACSCalibur, BD公司，USA)，熒光定量PCR儀(LightCycler480II, Roche公司，Switzerland)，熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i, Japan)，水平電泳儀(HE-120，上海天能科技有限公司)，超凈臺(BHC-1300ⅡA/B2，上海蘇凈實業有限公司)。

TDCPP(純度>96%，上海泰坦科技股份有限公司)，高糖培養基DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，青鏈霉素(上海生工生物工程股份有限公司)，胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)，MTT(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V -FITC/PI凋亡試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，活性氧檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Beta actin mouse monoclonal抗體(Proteintech Group公司)，Bax rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，Bcl-2 rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，Caspase-3 rabbit polyclonal抗體(Proteintech Group公司)，N-乙酰半胱氨酸(NAC, 純度99%，上海阿拉丁試劑有限公司)，其余試劑為分析純。

1.3 細胞培養與TDCPP溶液配制

L-02細胞接種含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養基中，用25 cm2無菌的細胞培養瓶培養，置于CO2培養箱中，37 ℃、5% CO2條件下生長。24 h后，37 ℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)輕緩漂洗細胞2次，再加5 mL培養液繼續培養，每隔2日更換培養液。顯微鏡下觀察到細胞生長達70%～80%時，用0.25%含EDTA胰酶消化，4 ℃條件下1 000 r·min-1離心5 min后傳代。

TDCPP溶液配制：稱取430.9 mg TDCPP于10 mL容量瓶中，二甲基亞砜(DMSO)定容，得到100 mmol·L-1母液，4 ℃儲備，臨用前，用完全培養基依次配制成100、50、25、5、1 μmol·L-1的TDCPP溶液。以含1‰ DMSO的完全培養基作為對照組。

1.4 細胞相對活力檢測

取一瓶對數生長期細胞，PBS漂洗細胞2次，胰蛋白酶消化后制成濃度約為1×104個·mL-1的細胞懸液，再轉移至50 mL無菌離心管搖勻，均勻接種于96孔培養板中(6×10排孔加200 μL細胞懸浮液，孔板周圍一圈加入200 μL PBS)，每取加6孔搖勻一次。于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內培養過夜(16 h)。棄液，加入含100、50、25、5、1、0 μmol·L-1的TDCPP污染物培養基，每個濃度設5個重復孔，并設置調零孔，繼續培養1、2、3 d。培養結束后，每孔加入20 μL MTT液(5 g·L-1)，繼續培養4 h。吸去上液，加150 μL DMSO至每孔中，37 ℃條件下振蕩10 min后于用酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)，3次重復，并計算其平均值，并按公式(1)計算細胞相對活力。

RAC(%)=(OD濃度-OD調零)/(OD對照-OD調零)×100%

(1)

RAC為細胞相對活力；OD濃度為實驗組吸光度值；OD調零為調零組吸光度值；OD對照為對照組吸光度值。

1.5 細胞凋亡檢測

利用Annexin V -FITC/PI雙染標記，流式細胞術(flow cytometry, FCM)來對細胞凋亡進行檢測。當細胞密度生長達到70%～80%，胰蛋白酶消化后制成濃度約為1×105個·mL-1的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔加入2 mL，在37 ℃、5% CO2培養箱內培養過夜(16 h)，吸去舊液，加入含不同濃度的TDCPP污染物的完全培養基以及NAC(1 mmol·L-1)和NAC(1 mmol·L-1)+100 μmol·L-1TDCPP的完全培養基，對照組為含1‰ DMSO的完全培養基，設置3復孔于每組濃度。于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養24 h后，棄舊培養基，用PBS清洗細胞2次，每孔加入0.25%不含EDTA胰蛋白酶400 μL，將消化細胞收集于離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再用1 mL PBS洗細胞2次，然后棄上清，每管加入350 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC染液，室溫避光條件下孵育15 min，再加入10 μL PI染液，室溫下避光染色5～10 min，1 h內用流式細胞儀進行凋亡率檢測，使用Flowjo 7.6.1軟件對結果進行分析。

1.6 細胞活性氧水平(ROS)測定

取對數生長期的細胞，胰酶消化將細胞制成分散的單細胞懸液，調整細胞密度至5×104個·mL-1，然后接種于96孔培養板中，在每孔中加入100 μL細胞懸液，在37 ℃、5% CO2條件下培養過夜，棄液，將含不同濃度的TDCPP污染物完全培養基加入黑孔板，陽性對照組按活性氧試劑盒說明1:1 000稀釋使用(Positive組)，陰性對照組加入為含1‰ DMSO的完全培養基，每組5復孔。在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養24 h后，移去上清液，每孔加入100 μL DCFH-DA應用液(10 μmol·L-1)，37 ℃條件下避光孵育25 min后，去DCFH-DA染液，用無血清培養液清洗細胞3次，然后加入100 μL PBS，用熒光酶標儀(Ex: 480 nm, Em: 538 nm)測定熒光強度，通過熒光強度反映細胞內的氧自由基水平。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

細胞總RNA提取：接種于6孔板中的細胞經過不同濃度的TDCPP暴露后，按試劑盒說明書方法提取細胞總RNA，并用Nanodrop2000C型分光光度計檢測RNA純度和含量。

cDNA合成：按天根公司試劑盒說明書合成cDNA。

目的基因檢測：按表1加qRT-PCR反應體系，定量的相關引物序列如表2，以β-actin作為內參基因。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

收集不同濃度暴露后的細胞，使用細胞裂解液提取總蛋白，根據BCA法測得的蛋白濃度確定上樣體積(以上樣量為50 μg計算體積)，垂直電泳后將蛋白電轉至不同的硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加Bax、Bcl-2或caspase-3兔源多克隆抗體，4 ℃條件下封閉過夜，TBST(三羥甲基氨基甲烷吐溫)緩沖液晃洗3次，每次15 min。然后加入鼠抗兔IgG二抗，常溫晃洗1 h，TBST洗3次，每次10 min。以β-actin為內參對照，以紅外激光成像系統掃描和分析圖像，最后計算蛋白相對表達量。

1.9 數據分析方法

采用SSPS 22.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數據進行方差分析和回歸分析。采用ANOVA方法分析實驗暴露組與空白對照組之間的差異，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。數據分析結果表示方式為均值±標準誤差。

表1 實時熒光定量PCR反應體系Table 1 Components of real time qPCR

表2 研究中的目的基因與引物序列Table 2 Genes and primers used in this study

圖1 磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)對L-02細胞生存率的時間、劑量影響效應注：數據表達采用均值±標準誤差，n=6；*P<0.05、** P<0.01，與對照組比較。Fig. 1 Dose and time-dependent toxic effects of tris(1,3-dicholor-2-propyl)phosphate (TDCPP) on cell viability of L-02 cellsNote: All data were expressed as mean±SEM, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

2 結果(Results)

2.1 TDCPP對人體肝細胞相對活力影響

如圖1所示，有機磷酸酯類阻燃劑TDCPP能影響L-02肝細胞存活率，并且細胞存活率與TDCPP存在時間、劑量效應關系。隨著染毒濃度從0 μmol·L-1向100 μmol·L-1的增加，染毒24 h的L-02細胞的存活率相對于對照組降至59.2%±2.8%，染毒48 h的L-02細胞的存活率相對于對照組降至38.0%±3.6%，染毒72 h的L-02細胞的存活率相對于對照組降至26.1%±3.9%。用SSPS22.0的線性回歸分析，計算得到相應的回歸方程y=a×x+b中a和b常量值，再將x(%)代表的存活率值設置為50，最后計算得到24 h、48 h、72 h的半數致死濃度(LC50)分別為116.56 μmol·L-1、81.89 μmol·L-1、65.11 μmol·L-1。對細胞活存活率影響表明TDCPP具有細胞毒性。

2.2 TDCPP影響人體肝細胞的凋亡

如圖2所示，TDCPP影響L-02細胞凋亡，使其凋亡率增加，且存在劑量效應關系。L-02細胞隨著染毒濃度增加其凋亡率均呈現遞增的趨勢，在低濃度1 μmol·L-1、5 μmol·L-1，細胞的早期凋亡率及晚期凋亡率增加不明顯。但在25 μmol·L-1時，細胞早期凋亡率增加，與對照組差異顯著(P<0.01)，細胞晚期凋亡率減少，50 μmol·L-1暴露條件下，細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增強，在100 μmol·L-1TDCPP染毒總凋亡率相對對照組具有顯著性差異，高達25.58%±1.612%。NAC組總凋亡率為2.30%±0.110%。NAC+100 μmol·L-1組總凋亡率為9.10%±0.631%，相對于100 μmol·L-1TDCPP總凋亡率明顯減少。但總體上看，在TDCPP暴露24 h條件下，L-02細胞的凋亡率明顯增強。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測暴露于TDCPP的細胞凋亡率注：A為對照組；B為1 μmol·L-1組；C為5 μmol·L-1組；D為25 μmol·L-1組；E為50 μmol·L-1組；F為100 μmol·L-1組；G為NAC+100 μmol·L-1組；H為NAC組；NAC為N-乙酰半胱氨酸。Fig. 2 Annexin V-FITC/PI assay of the apoptosis ratio of TDCPP-exposed L-02 cellsNote: A, control; B, 1 μmol·L-1; C, 5 μmol·L-1; D, 25 μmol·L-1; E, 50 μmol·L-1; F, 100 μmol·L-1; G, NAC+100 μmol·L-1; H, NAC; NAC stands for N-acetylcysteine.

2.3 TDCPP影響細胞活性氧水平

生物在代謝過程中會產生ROS這一中間產物，它具有重要的生理功能。在有害刺激條件下過量產生時，可造成機體細胞不同程度的氧化損傷。熒光探針DCFH-DA，是目前應用最為廣泛的一種檢測ROS的方法。本研究發現：24 h暴露后，細胞活性氧水平開始隨著TDCPP暴露濃度的增加而遞增，從5 μmol·L-1開始，ROS水平的變化與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，在100 μmol·L-1時達到一個最高水平，為對照組2.07±0.07倍，差異顯著(P<0.01)，這可能與高劑量刺激造成大量細胞氧化應激有關。

2.4 TDCPP影響p53凋亡信號通路基因表達

p53凋亡信號通路指的是p53介導的線粒體凋亡途徑：由于一些外界刺激，通過DNA損傷等引起細胞內p53蛋白水平升高，然后激活下游的線粒體凋亡途徑(細胞凋亡3條主要通路之一)中關鍵基因(基因包括p53、Bax、Bcl-2、Apaf-1、caspase-9、caspase-3等)的轉錄，誘導細胞凋亡[17]。p53凋亡信號通路是凋亡過程中重要的一條通路。

研究結果表明，隨著TDCPP濃度增加可以促凋亡基因Bax的表達，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，Bax/Bcl-2隨著暴露濃度增加而增加。此外，TDCPP處理組caspase-3、caspase-9、p53和Apaf-1的表達也增強(圖4)。p53基因是調控細胞增殖、細胞生長、DNA修復和凋亡相關基因，隨著暴露濃度增加p53mRNA的表達增強，在50 μmol·L-1、100 μmol·L-1表達量為對照組4.25±0.439，5.84±0.107倍，這可能部分解釋了本研究中TDCPP誘導的細胞凋亡率改變。caspase-9是凋亡執行基因caspase-3的上游，其表達量(表4)也隨著TDCPP濃度增加而增加。基因caspase-3的作用是作為凋亡最終的執行基因，在25 μmol·L-1暴露條件下暴露24 h后，其mRNA相對對照組表達量達到4.38±0.633倍。

圖4 不同濃度TDCPP暴露影響L-02細胞凋亡相關基因表達注：將β-actin作為內參基因；數據結果為與對照組的比值；n=3。Fig. 4 Effects of different concentrations of TDCPP on L-02 cell apoptosis-related gene expressionsNote: take β-actin as a reference gene; the results were relative to the control group and normalized using β-actin mRNA; n=3.

圖5 TDCPP影響L-02細胞凋亡蛋白表達(A：蛋白印跡；B：量化)Fig. 5 Effects of TDCPP on the protein expressions related to apoptosis in L-02 cells (A: Western blot; B: quantitation of the expressions)

實驗組Experiment groups早期凋亡/%Early stage apoptosis/%晚期凋亡/%Late stage apoptosis/%總凋亡/%Total apoptosis/%Control2.42±0.0570.38±0.3322.80±0.2761 μmol·L-13.00±0.0070.29±0.0143.29±0.0215 μmol·L-15.66±0.3251.08±0.3186.74±0.007?25 μmol·L-18.29±0.12??0.53±0.1068.81±0.014?50 μmol·L-117.75±1.344??5.74±0.742??23.49±0.601??100 μmol·L-125.30±1.556??0.28±0.05725.58±1.612??NAC+100 μmol·L-18.77±0.278?0.33±0.4119.10±0.631?NAC2.16±0.0370.14±0.0162.30±0.110

注：P<0.05、**P<0.01，與對照組比較。

Note： *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

表4 不同濃度TDCPP暴露后L-02細胞凋亡相關基因的相對表達量(平均值±標準誤差)Table 4 Relative gene expressions in L-02 cell after exposure to different concentrations of TDCPP (mean±SEM)

2.5 TDCPP影響Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達

Bax、Bcl-2和caspase-3是線粒體凋亡途徑中的關鍵蛋白。如圖5所示，L-02肝細胞經不同濃度TDCPP作用24 h后，促凋亡Bax蛋白表達水平隨濃度逐漸增加而遞增；抗凋亡Bcl-2蛋白表達水平隨濃度增加而遞減，且與對照組均有顯著差異性(P<0.05)；此外，Bax/Bcl-2兩蛋白間的比值關系是決定細胞凋亡的關鍵因素，在5 μmol·L-1、25 μmol·L-1和100 μmol·L-1TDCPP作用后，Bax/Bcl-2比值呈現上升趨勢，最高為對照組的4.34倍。同樣，caspase-3蛋白表達水平也隨濃度增加而增加，100 μmol·L-1時為對照組的3.50倍。

3 討論(Discussion)

肝臟是動物最重要的代謝器官，負責體內多種酶的合成以及外源有害物質的清除，對于維持生物體代謝平衡和消除外源物質毒性具有重要作用。在美國麻省總醫院的男性成人[18]和西雅圖地區兒童[19]的尿液樣品中都檢測到TDCPP主要代謝物BDCPP的存在，這表明TDCPP對人體健康有直接影響，并且人體肝臟是其重要的一個作用靶器官。因此研究利用人體正常肝細胞，研究其毒性效應及機制，對肝毒性具有直接的指示作用。Zhang等[20]利用人體肝癌細胞系HepG2/C3A研究TDCPP的半數效應濃度24 h-EC50和72 h-EC50為167.9 μmol·L-1和84 μmol·L-1，Crump等[14]利用禽類原代肝細胞的暴露實驗得到的半數致死濃度24 h-LC50為(62.0±37.7) μmol·L-1，本研究中利用MTT實驗評估TDCPP對人體正常肝細胞L-02暴露24 h、48 h、72 h的半數致死濃度(LC50)分別為116.56 μmol·L-1、81.89 μmol·L-1、65.11 μmol·L-1，結果表明對于TDCPP暴露的敏感性：禽類原代肝細胞<人體正常肝細胞<人體肝癌細胞。

生物機體廣泛存在的一種應激反應叫做氧化應激反應，在引起人類機體損傷中發揮十分重要作用。己有研究顯示，當機體組織中氧化與抗氧化調節系統失去平衡，脂質過氧化物含量增加，抗氧化酶活性降低，從而引起氧化應激反應，誘導細胞毒性發生。Zhao等[15]的研究表明，TDCPP暴露通過誘導細胞中ROS的產生，引起氧化應激和炎癥反應，進而引起細胞損傷。TDCPP暴露通過影響SH-SY5Y細胞的ROS生產，介導下游凋亡信號通路，引起細胞凋亡，在25、50、100 μmol·L-1時，ROS是對照組的1.3±0.1、2.2±0.1、2.9±0.2倍，凋亡率為7.1%±0.8%、10.3%±0.6%、30.3%±0.2%[21]。本研究中的L-02細胞中ROS水平和細胞凋亡率均與TDCPP的暴露濃度呈現正相關，并且在100 μmol·L-1時為對照組2.07±0.07倍，同時細胞凋亡率也高達25.58%±1.612%，但在加入抗氧化物質NAC時，細胞凋亡率降低，說明TDCPP引起的活性氧是引起細胞凋亡增加的原因。并且在5 μmol·L-1開始才與對照組有顯著性差異，這可能由于低濃度時細胞內ROS和自由基清除系統共同維持機體的氧化與抗氧化平衡，低濃度TDCPP對機體沒有明顯傷害。但是當ROS產生量超過機體本身系統處理的平衡時，機體會刺激形成氧化應激反應，引起組織或細胞內氧化還原信號蛋白質發生氧化性修飾、脂質過氧化、內質網應激、線粒體功能改變、DNA氧化損傷等，進而引發特定信號級聯激活，誘導細胞凋亡[22]。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的2個主要途徑之一，主要特征是細胞色素C滲漏到細胞質中，而細胞色素C由Bcl-2蛋白家族控制，其中促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的是2個關鍵成員，在細胞凋亡調控過程中起著重要的作用，并且細胞色素C可以與Apaf-1相互作用而激活caspase家族，最終導致細胞凋亡[23]。本研究結果表明，TDCPP可以增加促凋亡基因BaxmRNA的表達，抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達，證明TDCPP的增加激活了線粒體相關的凋亡通路。Bax/Bcl-2是凋亡信號傳導的重要參數，利用蛋白印跡法檢測蛋白表達結果，隨著TDCPP濃度增加Bax/Bcl-2比值也逐漸增大，caspase-3蛋白變化也具有同樣變化趨勢。p53基因是調控細胞增殖、細胞生長、DNA修復和凋亡相關基因，研究發現p53 mRNA的表達量與TDCPP的暴露濃度呈現正相關，說明TDCPP能夠將線粒體相關的凋亡通路中p53通路激活，從而影響細胞凋亡。caspase-9是起始凋亡基因，caspase-3是凋亡執行基因，本研究中TDCPP處理組caspase-3、caspase-9和Apaf-1的表達也明顯增強。這也從影響caspase家族基因表達方面解釋了本研究中TDCPP誘導細胞凋亡率逐漸增加的現象。

綜上所述，TDCPP對人體正常肝細胞L-02細胞活力具有明顯抑制作用。此外，TDCPP造成細胞氧化應激反應，引起細胞內ROS水平增加，同時通過影響p53、Bax、Bcl-2、Apaf-1、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達，從而激活線粒體凋亡通路，進而誘導細胞凋亡，引起細胞凋亡率增加。本文從細胞、生化和基因水平上系統評估TDCPP對L-02細胞的毒性作用，對TDCPP的環境與人體健康風險評價具有重要意義。

致謝：感謝課題組全體成員在實驗研究過程中的幫助與支持。