紡織品中雙酚A檢測用表面等離子體共振傳感器的表面預處理

李正海， 劉 芳， 黃 玨， 薛文良， 錢競芳

(1. 東華大學 紡織面料技術教育部重點實驗室， 上海 201620； 2. 佛山中紡聯檢驗技術服務有限公司，廣東 佛山 528000； 3. 中華人民共和國上海海關， 上海 200120)

雙酚A(BPA)在紡織服裝生產過程中常充當顯色劑，被廣泛應用于變色功能紡織品的熱敏變色印花上[1]，但BPA是一種環境激素，在長期與皮膚密切接觸時可導致人體內分泌失調，致使生殖功能下降，并且對胚胎具有一定的致畸性和毒性，存在誘發體內細胞癌變的風險[2]。在經濟全球化的時代背景下，進出口服裝的質量安全問題也備受各個國家的關注。加拿大是世界上首個將BPA列為有毒化學物質的國家，宣布將控制BPA 的使用[3]。

表面等離子體共振(SPR)現象是一種基于折射率變化的物理光學現象[4]。當偏振光入射角超過臨界角時會發生全反射，在金屬膜中產生消逝波，偏振光被耦合入表面等離子體內，界面上的等離子體就會與消逝波發生共振，即SPR原理[5-6]。SPR技術由于檢測過程方便快捷、無需精度提純、特異性識別度高、可實時監測等優點，已經在醫學診斷、化學檢測、生物技術、食品安全等眾多領域得到了應用，并且正逐漸地向消費品檢測領域擴展。在使用SPR技術直接檢測時，通常只有相對分子質量高于2 000的物質產生的共振才能得到相對顯著的SPR信號。但雙酚A相對分子質量很小，僅為228，且紡織品中雙酚A的含量相對較低，直接采用SPR技術檢測低濃度的雙酚A幾乎難以得到響應信號，因此需要對傳感器芯片進行修飾以得到放大信號來實現高靈敏度檢測。

目前傳感器芯片常用的修飾方法有直接吸附法、金屬螯合法、共價偶聯法、親和素-生物素結合法等[7]。在對紡織品中BPA的檢測研究中，可利用BPA-琥珀酰亞胺酯和BPA-卵清蛋白偶聯物來對傳感器芯片進行電修飾，但該方法檢測過程復雜，偶聯物修飾不穩定，檢出限低[8]。此外，有研究者分別利用TiO2/Au 復合膜酪氨酸酶和卡那霉素分子印跡技術等方式對芯片表面進行預處理，但該方法對納米TiO2材料、交聯劑和引發劑的要求較高，使得檢測成本過高[9-10]。本文利用BPA-牛血清蛋白抗原(BPA-BSA)與雙酚A抗體的特異性結合原理，采用SPR技術競爭法檢測紡織品中的雙酚A，以探索芯片在檢測前期進行BPA-BSA的修飾方法及最佳修飾條件。

1 競爭法檢測雙酚A原理

用SPR進行小分子物質競爭檢測時存在圖1所示的2種不同方式來提高信號的強度：一種是2個待測物競爭傳感器表面的同一抗原，即表面競爭；另一種是待測物和傳感片上固定的物質競爭溶液中的抗原，即溶液競爭[11]。

圖1 SPR競爭法的2種方式Fig.1 SPR competition in two ways

將具有特異性吸附屬性的生物蛋白抗原通過一定的技術固定于金屬膜表面后，依據反應的響應程度來判斷溶液中被分析物與該抗原的結合的動力學過程[12]。當目標物流過經固定抗原后的金膜表面時，便可與抗原產生特異性結合，從而共振使反射光譜發生變化，將結合物分子量的變化以光學信號的形式反映出來，實現實時傳感檢測；因此，作為實驗第1步芯片的表面修飾就顯得極其重要。本文將探索在溶液競爭法檢測紡織品中BPA過程中傳感芯片的選擇、修飾和抗原固定的最佳實驗條件。經修飾后的芯片可與抗原進行共價鍵結合，有效消除抗原的非特異性吸附，從而很大程度上提高了SPR分析靈敏度。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

H-SPR表面等離子體共振儀。

傳感芯片：羧甲基葡聚糖組裝(CM5) 芯片、裸金芯片(Au)。

2.2 實驗溶液的配制

2.2.1芯片修飾溶液

2-嗎啉乙磺酸(MES)溶液：質量濃度為0.009 76 g/mL，pH值為6.0。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)溶液：質量濃度為0.003 875 g/mL，溶劑為MES溶液。

N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液：質量濃度為0.004 34 g/mL，溶劑為MES溶液。

乙醇胺-鹽酸溶液：濃度為1 mol/L，pH值為8.5。

11-巰基十一烷酸(11-MUA)的乙醇溶液：質量濃度為0.00 109 g/mL，溶劑為無水乙醇。

2.2.2測試溶液

醋酸鹽緩沖液：取4.9 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸鈉溶液和5.1 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液進行混合，用三級水和氫氧化鈉溶液將混合溶液濃度調至0.01 mol/L，pH值為4.5。

雙酚A-牛血清白蛋白(BPA-BSA)溶液：將購買的BPA-BSA原溶液用醋酸鹽緩沖液稀釋至100 μg/mL，備用。

2.3 實驗步驟

2.3.1芯片修飾原理

本文實驗分別使用裸芯片(Au)和具有一層羧甲基葡聚糖修飾CM5芯片。由于裸芯片表面沒有羧甲基葡聚糖，故需對其表面進行羧化。羧化后的裸芯片和CM5芯片一樣具有羧甲基葡聚糖，待測物的BSA偶聯物會因共價鍵的極性作用與葡聚糖表面進行結合，如圖2所示。

圖2 芯片修飾氨基偶聯示意圖Fig.2 Schematic diagram of amino-coupling of chip modified

2.3.2裸芯片修飾步驟

1)取全新裸芯片，用1 mmol/L的11-巰基十一烷酸(11-MUA)溶液浸沒，在4 ℃條件下浸泡12 h；

2)取出裸芯片，用滅菌三級水清洗，隨后用N2吹干；

3)將芯片放入SPR儀中，通入滅菌三級水，設置流速為300 μL/min，得到穩定基線；

4)通入EDC和NHS(體積比為1∶1)300 μL，設置流速為20 μL/min，使傳感片表面的羧基活化為酯基；

5)通入300 μL BPA-BSA偶聯物溶液(醋酸鹽溶液稀釋，pH值為4.5，濃度為0.01 mol/L)，設置流速為20 μL/min；

6)通入100 μL pH值為8.5的乙醇胺-鹽酸(MUA)溶液，設置流速為20 μL/min，封閉未反應的活化羧基官能團。

2.3.3CM5芯片修飾步驟

全新CM5芯片表面已修飾了羧甲基葡聚糖，存在穩定Au—S鍵，故只需進行2.3.2節中3)～6)步驟。

3 結果分析

3.1 不同芯片修飾后溶液測試曲線

取CM5芯片和經羧化后的裸金芯片分別放入SPR儀，調節室溫至25 ℃，調節流池流速為20 μL/min，具體步驟如下：1)通入醋酸鹽緩沖溶液，直至基線穩定；2)通入某一濃度的BPA-BSA偶聯物溶液(醋酸鹽溶液稀釋，pH為4.5)300 μL，設置流速為20 μL/min；3)通入醋酸鹽緩沖溶液5 min清洗芯片。該反應采用國際單位RU來衡量：1 RU=1 pg蛋白/mm2=1×10-6RIU(折射指數單位)。圖3示出質量濃度為40 μg/ mL的BPA-BSA溶液的吸附響應曲線。由于BPA-BSA溶液的濃度不同，使得在芯片上與酯基反應的氨基數量也不同，引起的RU響應值也不同(②段和①段RU的差值)。

①段為通入緩沖液基線穩定階段；②段為通入的BPA-BSA偶聯物溶液反應階段；③段為通入醋酸鹽緩沖溶液清洗階段。圖3 2種修飾后芯片的BPA-BSA溶液測試曲線Fig.3 Test diagram of BPA-BSA solution of two modified chips

由圖3可知，CM5芯片由于自身金膜上已修飾羧甲基葡聚糖，故而在反應中，曲線穩定，響應值明顯。裸芯片經11-巰基十一烷酸(MUA)修飾后，表面雖覆有羧甲基葡聚糖，但在同樣的反應條件下，所得曲線不太穩定，存在上下浮動。故在對芯片進行修飾時，CM5芯片比裸芯片更為穩定，為保證后續實驗數值的穩定性，將選用CM5芯片進行實驗操作。

3.2 不同pH值緩沖液的溶液測試曲線

將BPA-BSA固定在CM5型傳感片上時，還需考察靜電吸附等因素。BSA的等電點是4.9，而通常溶液的pH值在3.0～4.9之間時，最有利于BPA-BSA的吸附。本文實驗中考察了pH值在3.5～6.0之間時，BSA在CM5傳感片上的靜電吸附行為。用醋酸和NaOH調節偶聯物溶液的pH值，以0.5為pH值梯度分別配制pH值為6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入25 μL醋酸鹽緩沖液來獲取實驗基線，設置流速為5 μL/min，再依次通入上述pH值的BSA-BSA溶液樣品各2 min，響應曲線如圖4所示。

圖4 不同pH值抗原溶液固定響應圖Fig.4 Response diagram of antigen solution at different pH values

由圖4可知：由于pH值為6.0、5.5時，高于BSA的等電點，使得BSA帶負電，所以吸附作用極弱；而在pH值為5.0時，BSA略帶負電，但仍然能在CM5傳感片上有較強的吸附行為(RU響應增加)；當pH值為4.5時，吸附量達到最大。通?？刹扇〗档腿芤簆H值的方法來增強靜電吸附，因此，選取固定BSA溶液的pH值為4.5。

3.3 不同離子強度緩沖液的溶液測試曲線

醋酸鈉緩沖液在實驗中不僅能為BSA提供酸性環境，還能最大限度地激發抗原的活性，使特異性結合得更加牢固。本文實驗使用的BPA-BSA醋酸鈉溶液的質量濃度為27.22 g/L，pH值為4.5，再用NaCl溶液調節離子濃度分別為100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL三級水來獲取實驗基線，設置流速為20 μL/min，再分別通入不同離子濃度的偶聯物樣品，響應圖如圖5所示。

圖5 不同離子濃度抗原溶液固定響應圖Fig.5 Response diagram of antigen solution at different ion concentrations

由圖5可看出：當離子強度分別為100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液通入流池后，結合量的響應值分別為25、35、102 RU；隨著離子濃度的降低，吸附響應值越明顯，當離子濃度為10 mmol/L時，吸附效果最好。

3.4 不同濃度BPA-BSA的吸附響應曲線

為了使抗原蛋白能在最大程度上固定到芯片傳感器表面，本文對不同濃度的BPA-BSA進行了實驗。選取前述最佳離子濃度為10 mmol/L、最佳pH值為4.5的醋酸鹽緩沖溶液，配制質量濃度分別為20、30、40、50、60、70、80 μg/ mL的BPA-BSA偶聯物溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL醋酸鹽緩沖液來獲取實驗基線，設置流速為20 μL/min，隨后依次通入上述不同濃度的BPA-BSA偶聯物樣品各5 min，響應圖如圖6所示。

圖6 不同濃度的BPA-BSA溶液對應的相對響應圖Fig.6 Response diagram of BPA- BSA solution at different concentrations

由圖6可知：當BPA-BSA溶液的質量濃度低于30 μg/ mL時，相對響應值隨著質量濃度的增加而不斷增大；當BPA-BSA溶液的質量濃度在30～50 μg/mL之間時，相對響應增勢放緩；當BPA-BSA溶液的質量濃度大于50 μg/ mL時，相對響應幾乎不再變化，只在一定的范圍內波動。故BPA-BSA溶液的最佳質量濃度可確定為50 μg/ mL。

4 結束語

本文建立了紡織品中雙酚A溶液競爭法檢測前芯片的氨基偶聯預處理方法。該方法與傳統的雙酚A檢測前處理方法相比，特異性識別度高，避免了其他雜質對實驗的影響，可在紡織品雙酚A檢測前處理中予以應用。

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