響應面法優化杏鮑菇液體發酵培養基

翟宏偉　陳曉明

摘 要：設計并通過響應面優化了一種適用于杏鮑菇（Pleurotus eryngii）液體發酵的新培養基TSM-1。以單因子試驗篩選出指標具有顯著影響的TSD-1微生物生長促進劑，液體多肽蛋白肥和NaCl，并通過Box-Behnken設計以及響應面分析得到了3因子最優添加量，形成TSM-1培養基的最優配方：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl 0.15 g，復合維生素B片1片（市售OTC成藥），添加TSD-1微生物生長促進劑0.3 g，鈣蛋白2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.4，121 °C滅菌30 min。優化后TSM-1培養基中杏鮑菇菌絲生物量可達18.70 ±0.03 g·L-1。

關鍵詞：杏鮑菇；培養基；優化；響應面

中圖分類號：S646 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.09.014

Optimization of Pleurotus eryngii Liguid Fermentation Medium by Response Surface Methodology

ZHAI Hongwei， CHEN Xiaoming

（Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，China）

Abstract： A new Pleurotus eryngii liquid culture medium named TSM-1 was designed and optimized by response surface methodology. Three factors were selected by single factors experiment including TSD-1 microbial growth promoter， liquid protein fertilizer and NaCl. The optimum additive amounts of three factors were determined respectively by Box-Benhnken design and response surface analysis. The optimum formula of TSM-1 culture medium was as follows： glucose 40 g， yeast extractor 10 g， KH2PO4 1 g， MgSO4·7H4O 0.5 g， NaCl 0.15 g， multivitamin tablet1piece， addingTSD-1 0.3 g， liquid protein fertilizer 2 g， distilled water 1 000 mL， pH=6.4， sterilization at 121 ℃ after 30 min. Under the optimized TSM-1 medium， the biomass of Pleurotus eryngii was reached to 18.70±0.03 g·L-1.

Key words： Pleurotus eryngii； culture medium； optimization； response surface methodology

自1948年以來，利用液體層發酵技術培養各種食用菌引起人們的極大重視[1]。相對于食用菌的固體培養而言，液體培養既可以縮短培養周期又提高了培養效率，特別適合于食用菌的規模化、周年化、工廠化生產，要實現杏鮑菇的大規模商品化生產，應用液體菌種是必然。截至目前，有關杏鮑菇液體培養均集中于杏鮑菇對不同碳氮源的利用上，但有關生長促進劑在食用菌液體發酵培養基中的應用鮮有報道。

因此，筆者嘗試設計并優化了一種新的適用于杏鮑菇的液體深層發酵培養基TSM-1，并添加了食用菌生長促進劑TSD-1、鈣蛋白制劑、滲透壓調節劑NaCl，以響應面法對TSM-1液體培養基中這3種特殊成分進行優化，以培養基中杏鮑菇菌絲的最大生物量為標準，確定了TSM-1液體培養基的最優配方，為食用菌生長促進劑在杏鮑菇液體深層發酵上的應用打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌種杏鮑菇（Pleurotus eryngii）由天津市林業果樹研究所保藏，編號：杏5。

種子及對照培養基為CM培養基配方為：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，KH2PO4 0.46 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min[2]。

測試培養基為自行設計的TSM-1液體培養基，具體配方為：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl，復合維生素B片1片（市售OTC成藥），TSD-1微生物生長促進劑，鈣蛋白，蒸餾水1000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min。

其中，TSD-1微生物生長促進劑由天津市天壽食用菌有限公司購得，主要成分為：己酸二乙氨基乙醇酯，精氨酸，牛磺酸。鈣蛋白制劑，即液體多肽蛋白肥，由天津市紐艾格農業科技有限公司提供，主要成分為：氨基酸100 g·L-1，多肽50 g·L-1，Ca 30 g·L-1，Mg 10 g·L-1，Zn以及B 4 g·L-1。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計 通過確定因子數量的Plackett-Burman設計以及確定因子水平最佳組合區域的最陡爬坡預備試驗[3]，篩選出TSD-1微生物生長促進劑的濃度范圍為0.03%～0.04%，鈣蛋白濃度范圍為0.2%左右，NaCl濃度在0.1%～0.2%之間。采用Box-Benhnken（BBD）試驗設計[4]，以TSD-1微生物生長促進劑添加量為因子A，鈣蛋白制劑添加量為因子B，NaCl添加量為因子C，以發酵液中菌絲球最大生物量（干質量）為響應變量，進行因子水平的響應面分析試驗，共生成17次獨立試驗，析因部分試驗次數為12次，中心點重復試驗為5次，響應曲面因子及水平見表1，試驗計劃見表2。

1.2.2 培養基的制備 各處理培養基配置并定容，以5% NaOH以及5% HCl調節pH值至杏鮑菇菌絲體最適pH值6.4[5-6]，裝入250 mL廣口三角瓶，每瓶85 mL，8層紗布封口并加蓋雙層牛皮紙，121 °C滅菌30 min，冷卻后接種，CM液體培養基作為對照組，制備方法與測試培養基相同。

1.2.3 菌絲培養及生物量測定 取4 °C冰箱中保藏的杏鮑菇試管母種，置于25 °C恒溫培養箱中活化48 h后，接種于CM液體培養基中，每瓶接種3小塊。接種后搖瓶揭去牛皮紙并置于恒溫搖床中，160 r·min-1，25 °C避光培養5 d，待液體培養基中出現細碎菌絲球時，經酚紅肉湯無菌檢查[7]后，用無菌移液管吸取5 mL種子液（接種量約5%），接種于測試培養基各處理以及對照培養基中，置于恒溫搖床中，160 r·min-1，25 °C避光培養96 h，以菌絲體干重法[8-9]測定生物量并求取平均值。

1.3 數據統計與分析

通過軟件Design-Expert.V8.0.6對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

經過96 h的發酵后，各培養基處理配方及其重復中杏鮑菇菌絲的生物量見表2。由表2可以看出，處理3、5、10、13和17，即TSD-1濃度0.03%，鈣蛋白濃度0.20%，NaCl濃度0.15%時，杏鮑菇菌絲體生物量最高，其均值在18.37～18.79 g·L-1之間，較CK提高了164.32%～170.36%。

2.2 模型建立及顯著性分析

利用Design-Expert.V8.0.6對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合[4]，則杏鮑菇菌絲在TSM-1培養基中發酵96 h后的生物量干質量（Y）對TSD-1微生物生長促進劑添加量（X1），鈣蛋白添加量（X2），NaCl添加量（X3）的實際值全變量二次多項回歸方程為：

Y=-23.318+439.959X1+164.530X2+32.923X3- 552.475X1X2+6.808X2X3-4 492.934X2 1 -391.326X2 2-116.016X2 3

對該回歸模型進行方差分析結果見表3，回歸模型系數的顯著性檢驗結果見表4。

由表3可知，回歸模型統計學效應極顯著且擬合度良好，該模型方程可以解釋97.8%的響應值（杏鮑菇菌絲體生物量）的變化，說明可以用該模型預測不同TSM-1液體培養基中添加物的含量與杏鮑菇菌絲生物量得率的最優解；但該模型的修正R2與預測R2之間尚有一定差距，表明不能使用該模型預測真實結果，尚需驗證試驗[10-11]。

從表4中可以看出，模型一次項表明除NaCl外，因子對杏鮑菇菌絲生物量的影響都達到了極顯著（P<0.01）水平，3個因素影響的顯著程度排列順序為：鈣蛋白添加量>TSD-1添加量>NaCl添加量；所有二次項對菌絲生物量影響亦達極顯著水平（P<0.01）；根據各項F值大小，可知TSM-1液體培養基添加物在各因子的交互作用中，TSD-1×鈣蛋白（X1×X2）>鈣蛋白×NaCl（X2×X3）>TSD-1×NaCl（X1×X3），其中TSD-1（X1）與鈣蛋白（X2）交互作用達顯著水平（P<0.05），說明其響應值對菌絲生物量有顯著影響（P<0.05），而其余交互項對響應值的影響均不顯著（P>0.05）。

根據回歸分析結果，對TSD-1×鈣蛋白，鈣蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl各因素之間的交互作用對杏鮑菇菌絲生物量的具體影響進行作圖（圖1）。從圖1可以看出，TSM-1液體培養基中，杏鮑菇菌絲生物量隨著TSD-1微生物生長促進劑添加量和鈣蛋白先增加后降低，顯示出明顯的碳氮比效應，且鈣蛋白的影響較TSD-1明顯。TSD-1與鈣蛋白中都含有豐富的氮源，因此二者的交互作用主要體現在因子的不同組合引起的速效遲效氮的變化方面。

結合圖1和表4，在TSM-1液體培養基中，交互作用鈣蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl幾乎是不存在的，作為滲透壓調節劑的NaCl，在高的葡萄糖含量（40 g·L-1）的TSM-1培養基中，其效應很可能被葡萄糖掩蓋而無法顯現。

2.3 驗證試驗

根據回歸模型，通過軟件分析得到上述3因子的最優添加量為：TSD-1微生物生長促進劑0.03%，鈣蛋白0.2%，NaCl 0.15%，在此條件下，三次平行驗證，TSM-1培養基中杏鮑菇平均菌絲生物量為18.70±0.03 g·L-1，與預測值吻合良好，為對照組CM培養基的2.7倍。

3 結 論

（1）TSM-1液體培養基具體配方優化為：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，復合維生素B片1片（市售OTC成藥），添加TSD-1微生物生長促進劑0.3 g，鈣蛋白2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min。

（2）杏鮑菇菌絲在優化的TSM-1培養基中，160 r·min-1，25 °C下培養96 h后，其生物量為18.70±0.03 g·L-1，相當于傳統CM培養基的2.7倍。

（3）NaCl在高滲的TSM-1液體培養基中對杏鮑菇菌絲影響不大。

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