人類腸道微生物研究進展

李蔚然 陳 珉

(華東師范大學生命科學學院 上海 200241)

1 技術背景

人類腸道微生物數量龐大、種類繁多，被稱為“第二基因組”[1]，與機體健康有著極為密切的聯系。近年來，腸道菌群研究已成為生物學領域的研究熱點之一。微生物組研究技術的迅猛發展，使得進一步了解腸道微生物與人類機體的系統發育以及健康的關系成為可能。

腸道菌群的研究主要集中于對腸道中微生物多樣性(包括數量、種類和組成)的認識。早期主要采用微生物鑒定和分類的方法，在此基礎上進一步了解其功能活性，研究方法如革蘭氏染色法、糖發酵試驗、IMViC試驗等： 是通過微生物的分解糖類的能力、是否產酸、產氣等理化性質進行物種的鑒定與分類。腸道微生物的研究也正是基于這些技術手段而逐步發展起來的。

微生物普查大約始于25年前。最初使用的方法是16S rRNA基因測序[1]，先利用PCR技術克隆16S rRNA基因，再通過兩到三次Sanger法測序(一代測序)完成整個基因的測序。對不同個體進行比較時，只需確定序列的光譜是否相似并判斷差異程度。但Sanger法測序的讀取長度僅為幾百個堿基，每次只能獲得部分取樣基因的序列，靈敏度低，且成本昂貴，限制了取樣深度，對低豐度微生物的分析十分有限。目前已開發出了下一代測序技術，又稱二代測序技術或高通量測序技術，一次可對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定。這種方法快速、經濟、通量高，每個樣品可產生高達數百萬的讀數，但缺點是讀取長度通常非常短[2]。隨后又發展出了三代測序技術，這是單分子測序技術，測序時無需經過PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。二代測序和三代測序技術對宏基因組學研究在廣度上和深度上都產生了巨大的影響，帶來了研究方法的變革。

宏基因組研究，即對整個群落的DNA進行測序，同時為編目群落中的生物體、基因和基因組提供更廣泛、復雜的微生物群落信息。高通量測序技術的出現使得對于一個物種的轉錄組和基因組進行全面深入的分析成為可能，并允許進行更大規模的宏基因組研究。

人類腸道微生物的第一次群體規模的宏基因組研究由MetaHIT實施，測定了腸道中的1150種常見菌種、330萬個基因[2]。人類微生物組計劃是迄今最大的人類微生物組研究，在Roche-454平臺上靶向16S rRNA基因的V3-V5區域、對健康志愿者樣本進行測序，確定無疾病個體微生物多樣性，通過16S擴增子測序分析和宏基因組測序確定群落組成和功能，鑒定了超過1000萬個基因，將MetaHIT腸基因編目擴展了近180萬個，還檢測了各個身體部位之間的微生物關聯[2]。人類微生物組含有3500至35000個物種水平的運算分類單位(OTU)[3]。胃腸道(包括口腔和糞便)是采樣部位中微生物最多樣化的，2012年的統計數據中包含了數千個OTU，共計約150個屬[4]。

隨著研究方法效率和精度的不斷提高，研究人員能快速地測得腸道微生物的DNA序列，通過生物信息學對這些數據進行分析以確定腸道微生物的種類和群落組成，并結合非基因組(蛋白質組學和代謝組學)的分析將微生物組的遺傳信息和群落結構與個體表型聯系起來。比對健康個體與疾病個體的腸道微生物，還能進一步探究微生物對人類健康的影響。近年來，相關研究取得了顯著的成果。

2 人類腸道微生物與健康的關系研究進展

2.1 腸道微生物與消化代謝 腸道是消化吸收的重要場所，腸道微生物對這一過程起著重要的調節作用。在盲腸和上行結腸中，碳水化合物發酵，微生物快速增長；而在橫結腸和下行結腸中氨基酸發酵，微生物增長速度變緩[5]。腸道菌群的基因組中存在許多編碼碳水化合物活性酶的基因，包括糖苷水解酶及糖基轉移酶等，可幫助宿主消化糖類[5]。

作為機體代謝的重要參與者，腸道微生物不僅能合成多種人體生長發育所必需的維生素(如雙歧桿菌、乳酸桿菌可以合成維生素B1、B2、B6和B12，以及維生素K和葉酸等)，還能促進礦物元素的吸收，幫助消化代謝[6]。研究表明，炎癥性腸病患者的糞便微生物群與健康受試者不同。例如，厚壁菌門在炎癥性腸病和感染性結腸炎患者中明顯不足[7]，而這些細菌可能是腸內穩態的關鍵，其數量的減少與腸黏膜的保護力降低表現出一定的相關性。有研究發現，腸道微生物群落的改變可能與患結腸或直腸癌的風險相關。Ahn等[8]擴增了結腸直腸癌患者和對照受試者糞便細菌的16SrRNA基因，以Roche 454(GS FLX titanium system)超高通量測序技術，用QIIME (quantitative insights into microbial ecology)管道對基因組進行分類，通過定量聚合酶鏈反應確認分類學差異。結果顯示患者整體微生物群落多樣性降低，厚壁菌門的相對豐度較低，其中梭菌屬的數量消減最為突出。革蘭氏陽性梭菌特別是糞球菌屬可以有效地將膳食纖維和其他復合碳水化合物發酵為丁酸鹽，而丁酸鹽可能是具有抑制結腸炎和抑癌作用的主要結腸代謝物。

2.2 腸道微生物與疾病 腸道微生物除了具有調節消化代謝的作用，還與糖尿病[9]、肥胖癥[10]、腎結石[11]等多種疾病緊密關聯。

Qin等[12]基于鳥槍法測序進行了宏基因組范圍關聯研究(MGWAS)，分析Ⅱ型糖尿病患者的腸道微生物，鑒定了60000種Ⅱ型糖尿病相關標記物，建立了宏基因組連鎖群的概念，實現了分類種級分析。結果表明，Ⅱ型糖尿病的特點是中度的腸道菌群生態失調、某些產丁酸菌的減少(如腸道念珠菌和糞腸球菌濃度在患者體內水平較低[9])和各種機會性病原體的增加。

科學家發現腸道微生物的群落結構與肥胖癥相關，肥胖癥會導致微生物多樣性降低[13]。如果肥胖者的腸道菌群恢復到健康狀態可以改善與肥胖相關的病癥并幫助維持健康的體重[2]。具有相同遺傳背景的、喂食低脂肪食物的無菌小鼠中移植了肥胖者腸道菌群的小鼠出現了肥胖癥，移植了瘦人腸道菌群的小鼠變瘦[14]；如果把肥胖小鼠的腸道菌群移植給瘦小鼠，原先的瘦小鼠也會出現肥胖[13]，同時攜帶肥胖者與瘦人菌群的小鼠，體重的增加以及和肥胖相關代謝表型的形成受到了抑制[14]。可見腸道微生物在肥胖癥中具有重要作用。

研究發現，草酸桿菌的定植與草酸鈣形成結石的風險降低表現出70%的關聯度[11]。草酸桿菌可在腸道中代謝草酸鹽，缺乏草酸桿菌可能會導致結腸吸收草酸鹽增加，造成尿中草酸鹽積累，有利于結石的形成[11]。

2.3 腸道微生物與免疫 早期B細胞發育可發生在腸固有層，受到共生微生物和腸免疫球蛋白庫細胞外信號的調節。實驗表明，當無菌小鼠接觸了微生物菌群，微生物在體內定植，腸固有層中特異性表達Igλ和Igκ的B細胞的比例將會增加[15]，從而影響B細胞的發育。

表達Foxp3轉錄因子的CD4+T調節性T細胞(Tregs)對維持免疫內環境的穩定具有關鍵作用。腸道微生物群的孢子形成組分，特別是梭菌屬的IV和XIVa簇可提供富含轉化生長因子-β的環境，影響結腸中Foxp3+Tregs的數量及其功能[16]。常規飼養的小鼠早期以口服方式接種梭菌，成年后會表現出對大腸炎和全身性免疫球蛋白E反應的抗性，這有可能成為治療自身免疫病和過敏反應的新方法。

人在衰老的過程中，腸道微生物的多樣性逐漸降低，先前罕見的致病菌株逐漸占據主導地位。Smith等[17]將青年非洲青鳉魚的糞便喂食給中年青鳉魚(自身腸道菌群經抗生素處理殺死)，吞食了青年小魚糞便的魚與對照組相比壽命顯著延長，運動能力也與青年小魚類似。這一實驗結果讓我們看到了腸道菌群移植對人類壽命延長潛在的積極效果，但目前的證據十分有限，未來進一步的研究或許能為延年益壽帶來更大的可能性。

2.4 腸道微生物與精神狀態 腸道菌群可影響哺乳動物的大腦發育以及成體行為。與具有正常腸道菌群的小鼠相比，無菌小鼠運動較多、焦慮較少[18]。這種行為表型與有關運動控制和焦慮樣行為的第二信使通路和突觸長期增強的基因在腦區域的表達改變相關。當無菌小鼠接觸了正常的腸道菌群，腳手架蛋白PSD-95(postsynaptic density protein 95)和突觸素在紋狀體中的表達減少[18]，從而影響控制運動和焦慮行為的神經元電路的信號機制。

腸道菌群還會影響神經系統的發育。胃腸道微生物群落異常的母體免疫激活(MIA)小鼠模型，表現出自閉癥譜系障礙[19](屬神經發育障礙)。如果用與人類共生的脆弱擬桿菌對MIA小鼠后代進行治療，可糾正腸道的通透性，改變微生物群落組成，進而改善交際的刻板、焦慮和感覺運動行為的缺陷[19]。

有研究分析了晚期黑色素瘤患者的腸道菌群樣本，發現對免疫治療產生應答的癌癥病人腸道中的細菌多樣性更高(尤其是產氣莢膜梭菌家族的細菌)，而且其體內能特異性殺傷腫瘤的免疫細胞數量也比免疫治療不響應的患者明顯增多。該研究還表明，在進行免疫治療前通過給予抗生素、益生菌或者移植糞便改變腸道菌群，能增加免疫治療藥物的效果，這些新藥目前已用于治療幾種不同類型的癌癥，但仍需要進一步的臨床試驗驗證。

3 展望

健康人的糞便移植到患者腸道，可重建腸道菌群。由于腸道微生物與營養代謝、免疫、神經發育相關，腸道微生物群落的改變會引發微生態結構改變，導致肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、腸炎等疾病，因此糞便移植可用于相關疾病的治療。

今后對于腸道微生物的研究將會更加深入、全面，將建立腸道菌群的基因組數據庫、完善腸道微生態生物學信息，進一步探究腸道微生物與人類疾病的關系、微生物與其宿主相互作用的機制以及如何通過改變微生物群治療疾病，加強人們對腸道微生物的認識，從而促進生物學、醫學以及食品等相關學科的發展，為人類健康做出貢獻。

現有的人類微生物組的研究方法正在不斷改進，測序技術也在飛速發展中。人類遺傳學和基因組學的同步進展提供了結合宿主基因型與微生物組表型研究的機會。未來的研究將整合宏基因組、轉錄組、代謝蛋白組和整個生態系統，并在診斷、治療和預防等方面得到應用。

(*通信作者)