膀胱癌中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與膀胱癌化療耐藥的研究

康川疆，周艷，姜睿

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 泌尿外科，四川 瀘州 646000；2.四川省遂寧市第三人民醫(yī)院 兒科，四川 遂寧 629000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一，因其發(fā)病率高、術(shù)后復(fù)發(fā)率高以及致死率高等特點(diǎn)導(dǎo)致膀胱癌治療頗為困難[1]。膀胱癌微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展和治療中發(fā)揮重要功能[2]，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages, TAMs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，相對(duì)于癌旁組織，腫瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞明顯增加，被激活為M2型巨噬細(xì)胞后釋放大量細(xì)胞因子，促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展[3]。

趨化因子生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因5[chemokine（C-X-C motif）ligand 5, CXCL5]屬于趨化因子CXC中ELR趨化因子的一員，最新研究發(fā)現(xiàn)CXCL5具有促進(jìn)腫瘤增殖、血管形成、粒細(xì)胞趨化及促進(jìn)炎癥反應(yīng)等功能[4-5]，本研究旨在探究膀胱癌通過(guò)分泌CXCL5招募巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞對(duì)膀胱癌化療耐藥性的影響，為膀胱癌治療提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1、人膀胱癌細(xì)胞系T24、253J及人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基和RMPI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，佛波酯（phorbol 12-myristste 13-acetate, PMA）、IL-4購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coming公司，F(xiàn)ibronectin購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒及PCR kit購(gòu)自日本TaKaRa公司，CXCL5敲減shRNA慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，CXCL5多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，PARP/cleaved-PARP購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology （CST）公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染

膀胱癌細(xì)胞T24、253J使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入100 μg/ml青霉素和鏈霉素（Sigma, USA），置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每2～3天對(duì)細(xì)胞換液處理，貼壁細(xì)胞每4～5天通過(guò)胰酶消化進(jìn)行傳代處理，THP-1細(xì)胞離心重懸進(jìn)行傳代處理。每次實(shí)驗(yàn)前使用160 nmol/L PMA細(xì)胞培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。shRNA慢病毒預(yù)實(shí)驗(yàn)感染確定T24細(xì)胞MOI值為5、253J細(xì)胞MOI值為10。調(diào)整細(xì)胞密度將T24、253J細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前用DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，使用Complete Mdeium稀釋polybrene至終濃度50 μg/ml，細(xì)胞加入5 μg/ml的polybrene和相應(yīng)體積病毒轉(zhuǎn)染T24、253J細(xì)胞48 h后，使用2～3 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選2～3周，熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)CXCL5的mRNA和蛋白表達(dá)。

1.3 人正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基提取

人正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞正常培養(yǎng)，胰酶消化離心后重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為2.0×106個(gè)/皿接種于10 cm皿中，待細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，將10 cm皿置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸取細(xì)胞上清液離心去除細(xì)胞碎屑，吸取離心后上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 THP-1源性巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基提取

THP-1細(xì)胞離心重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)并按2.0×106個(gè)/皿接種于10 cm皿中，PMA誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，更換新的培養(yǎng)基，再加入20 ng/ml的IL-4繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸取細(xì)胞上清液離心去除細(xì)胞碎屑，吸取離心后上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞增殖能力變化

膀胱癌細(xì)胞正常培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%消化進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×105個(gè)/ml，按照每孔200 μl接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組按照1∶1比例加入巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)36 h，加入濃度為2.0 μmol/L多柔比星，每種處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸去上清液，每孔加入含有10% MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，吸去上清液加入150 μl DMSO/孔，置于微量振蕩器勻速振蕩10 min，對(duì)照組未加入巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)光密度（OD）值，做出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 THP-1細(xì)胞招募實(shí)驗(yàn)

取5μm Transwell小室，倒置放置于10 cm皿中，小室下室膜上滴加20 μl Fibronectin并均勻鋪滿，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中4～6 h備用。THP-1正常培養(yǎng)，離心后使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml，取出已包被Fibronectin的小室取出置于24孔板中，小室下室加入1∶1稀釋的無(wú)血清條件培養(yǎng)基，上室加入200 μl的THP-1細(xì)胞懸液，將24孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，棉簽擦拭小室上室細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗加入結(jié)晶紫染色20 min，再次使用PBS清洗小室并使用棉簽擦拭上室殘留細(xì)胞，顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)

使用胰酶消化并傳代細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度至60%～70%時(shí)按照飛捷RNAfast 200試劑說(shuō)明書操作提取RNA，cDNA模板通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得，逆轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa Prime ScriptTMRT Master Mix試劑說(shuō)明書。CXCL5的mRNA表達(dá)檢測(cè)使用TaKaRa SYBR @ PrimixEx TaqTMⅡ反應(yīng)體系，引物序列：正向5'-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3'，反向5'-GCTTAAGCGGCAAACATAGG-3'。使用β-actin作為內(nèi)參，正向5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表達(dá)水平采用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行分析。T24和253J兩種細(xì)胞系未加入CXCL5敲減shRNA慢病毒作為對(duì)照。

1.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

使用胰酶消化并傳代細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度至60%～70%時(shí)加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，使用BCA法測(cè)定所提取蛋白濃度。取30μg蛋白使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)膜處理，PVDF膜使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入目的抗體CXCL5、PARP/cleaved-PARP、β-actin，放置在4℃冰箱搖床慢搖過(guò)夜孵育。使用TBST洗膜液洗膜10 min×3次，加入二抗孵育，并置于常溫?fù)u床1 h，TBST洗膜液洗膜10 min×3次，使用ECL顯影液進(jìn)行顯影。目的蛋白表達(dá)量通過(guò)與內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)計(jì)量資料組間比較采用多因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌細(xì)胞與正常膀胱上皮細(xì)胞招募THP-1細(xì)胞

SV-HUC-1組招募THP-1細(xì)胞數(shù)（85.400±5.528），膀胱癌細(xì)胞T24和253J組招募THP-1細(xì)胞數(shù)分別為（288.200±6.028）和（348.600±8.583），與正常膀胱上皮細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=42.950和44.650，均P=0.000），顯示膀胱癌細(xì)胞相對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞招募更多的THP-1細(xì)胞。

2.2 膀胱癌細(xì)胞與正常膀胱上皮細(xì)胞CXCL5表達(dá)水平

T24組與253J組膀胱癌細(xì)胞CXCL5的mRNA表達(dá)水平分別為（5.871±0.345）、（6.238±0.472），與正常膀胱上皮細(xì)胞（1.000±0.413）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.680和14.470，均P=0.000），CXCL5在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)升高。見(jiàn)圖1。

圖1 SV-HUC-1、253J、T24細(xì)胞CXCL5蛋白表達(dá)情況

2.3 膀胱癌細(xì)胞CXCL5敲減對(duì)THP-1細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

敲減膀胱癌細(xì)胞CXCL5表達(dá)見(jiàn)圖2。膀胱癌細(xì)胞系T24敲低組招募THP-1細(xì)胞數(shù)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。253J細(xì)胞敲低組招募THP-1細(xì)胞數(shù)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），顯示CXCL5敲減抑制膀胱癌細(xì)胞對(duì)THP-1細(xì)胞招募能力。見(jiàn)表1。

2.4 THP-1源性巨噬細(xì)胞對(duì)膀胱癌對(duì)多柔比星抵抗性的影響

膀胱癌細(xì)胞系T24共培養(yǎng)組細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。253J共培養(yǎng)組細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），THP-1源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可以增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的抵抗性。見(jiàn)表2。

圖2 T24、253J細(xì)胞CXCL5敲減后CXCL5蛋白水平

表1 膀胱癌細(xì)胞CXCL5敲減后招募巨噬細(xì)胞比較（±s）

表1 膀胱癌細(xì)胞CXCL5敲減后招募巨噬細(xì)胞比較（±s）

組別 招募細(xì)胞數(shù) t值 P值T24細(xì)胞系對(duì)照組 87.200±2.588 10.390 0.000 CXCL5敲低組 33.400±8.583 253J細(xì)胞系對(duì)照組 65.600±3.209 19.160 0.000 CXCL5敲低組 24.200±1.924

表2 THP-1源性巨噬細(xì)胞影響膀胱癌對(duì)多柔比星的抵抗性 （±s）

表2 THP-1源性巨噬細(xì)胞影響膀胱癌對(duì)多柔比星的抵抗性 （±s）

組別 細(xì)胞存活率/% t值 P值T24細(xì)胞系對(duì)照組 100.000±9.424 3.450 0.008共培養(yǎng)組 118.953±7.872 253J細(xì)胞系對(duì)照組 100.000±6.236 2.750 0.030共培養(yǎng)組 109.534±4.616

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中重要機(jī)制，TAMs在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要功能，既往報(bào)道發(fā)現(xiàn)TAMs在腎癌[6]、肝癌[7]、肺癌等[8]多種惡性腫瘤疾病中浸潤(rùn)增加，本研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中，膀胱癌細(xì)胞招募TAMs能力高于正常膀胱上皮細(xì)胞，TAMs很可能在膀胱癌惡性進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。

CXCL5是CXC族趨化因子成員[9]，趨化因子主要作用是作為化學(xué)引誘物介導(dǎo)細(xì)胞特異性遷移，吸引相關(guān)炎癥細(xì)胞的組織浸潤(rùn)。研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、胰腺惡性腫瘤[12]和腎癌[13]中高表達(dá)，而有關(guān)CXCL5在膀胱癌中對(duì)TAMs招募作用尚未報(bào)道。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞CXCL5表達(dá)高于正常膀胱上皮細(xì)胞，且CXCL5敲減能抑制膀胱癌細(xì)胞對(duì)THP-1細(xì)胞招募能力，說(shuō)明CXCL5在膀胱癌細(xì)胞對(duì)THP-1細(xì)胞招募過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

TAMs促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)TAMs高浸潤(rùn)增強(qiáng)多種惡性腫瘤如乳腺癌或胃癌患者對(duì)化療藥物耐藥及引起預(yù)后不良[14-16]，因此筆者想要探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞化療耐藥產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后加入多柔比星相對(duì)多柔比星對(duì)照組化療藥物對(duì)膀胱癌細(xì)胞殺傷作用明顯下降，說(shuō)明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的化療耐藥性。

綜上所述，膀胱癌細(xì)胞通過(guò)分泌過(guò)多的CXCL5招募巨噬細(xì)胞，同時(shí)招募的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠反向性作用于膀胱癌細(xì)胞，增強(qiáng)膀胱癌的化療耐藥性，對(duì)膀胱癌的治療提供了新的思路。