高強度聚焦超聲聯合竹紅菌素軟膏對外陰上皮非瘤樣病變組織中P16、CD34的影響*

張憲軍，陳志紅，李明，李桂芬，宋永禎

（河北省衡水市人民醫院 1.婦科，2.內科，河北 衡水 053000）

女性外陰處皮膚出現異常色素沉淀或黏膜組織變性被稱為外陰上皮內非瘤樣病變（non neoplastic intraepithelial lesions of vulva, NNED）[1]。 目前，對NNED的發病機制尚無明確的認知，可能與患者局部微循環缺陷、細胞周期異常有關[2]。高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound, HIFU）是近年來發展起來的一種新型無創NNED治療手段，具有操作簡單，對機體幾乎無創傷，療效顯著等特點[3-4]。竹紅菌素軟膏是一種涂抹于外陰處皮膚的外用藥物，具有抑菌作用[5]。臨床研究認為，兩者聯合運用對NNED的治療具有顯著效果。目前，普遍認為NNED的發生與細胞周期失調和微循環障礙有關。P16蛋白是參與抑癌基因調控和細胞周期調控的關鍵蛋白，CD34是高特異性血管內皮標志物[6-7]。這兩種蛋白在NNED的發生、發展中起到重要作用。本研究對比HIFU單獨治療和聯合治療對患者病變組織中P16和CD34蛋白表達水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年12月-2015年12月在該院進行治療的80例NNED患者為研究對象。其中，2013年12月以前入院的40例患者作為對照組，選擇2013年12月以后入院與其狀況相似的40例患者作為觀察組。對照組：年齡18～59歲，平均（43.6±4.1）歲；平均病程（4.3±0.6）年；硬化性苔蘚型（lichen sclerosis, LSV）6例、鱗狀上皮細胞增生型（squamous hyperplasia, SHV）30例、合并型（lichen sclerosis combined with squamous hyperplasia, LSCSH）4例。觀察組：年齡20～62歲，平均（44.9±3.2）歲；平均病程（4.1±0.8）年；LSV型4例、SHV型33例、LSCSH型3例。

經檢驗，兩組患者年齡、病程、病理分型等差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得醫院醫學倫理委員會的批準，所有患者均對研究內容知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：①所有入選患者均接受過其他治療，但出現復發；②年齡＜65周歲，＞18周歲；③患者治療依從性好；④自愿參與本研究。排除標準：①病變組織進行病理學檢查顯示為外陰癌和不典型增生者；②經期患者；③陰道急性炎患者；④存在心臟病、糖尿病、甲亢和惡性腫瘤患者；⑤對治療所用藥物過敏者。

1.2 研究方法

所有患者均接受HIFU治療。采用CAF型聚焦超聲治療儀（購自重慶海扶技術有限公司）進行治療。患者首先取截石位，功率3.7 W，頻率9.5 MHz，治療范圍為病變區及其外0.5 cm，速度為3～5 mm/s。探頭對準目標治療區域緊貼病變皮膚進行連續的直線掃描，控制掃描速率為2～3 mm/s，可根據患者自身病變區域大小和嚴重程度靈活調整治療時間，治療時間最少15 min，最長不得超過50 min。每3次治療為1個療程，每次治療之間間隔2周，所有患者均接受2個療程的治療。

在此基礎上，觀察組患者還接受竹紅菌素軟膏治療。觀察組患者進行HIFU治療時，將5 g竹紅菌素軟膏與超聲專用傳導介質耦合劑混合，并涂抹到目標治療區域，而后進行超聲治療。

1.3 觀察指標

療效評價：參考武愛芳等[8]建立的“外陰瘙癢評分法”“四度皮膚彈性評估法”“外陰白色病變面積計算法”，對治療前和治療2個療程結束后6個月患者外陰患處皮膚進行評價，以數字得分來表示患處皮膚狀態，得分越低分別表示患處皮膚瘙癢程度低、皮膚富有彈性和病變面積小。

組織P16蛋白和CD34蛋白水平檢測：采集所有患者治療前病變處皮膚組織，2個療程治療結束后6個月隨訪時，采集患者相同位置處皮膚組織。同時，治療前還需要采集所有患者病灶附近健康皮膚組織樣本，作為空白組。采集得到的皮膚組織中加入蛋白裂解液提取蛋白并進行Western blot檢測。采用Image J軟件對所得蛋白條帶的灰度值進行分析，設置空白組目的蛋白的含量為100，計算對照組和觀察組目的蛋白的含量相對值。

觀察治療過程中兩組患者出現不良反應的情況。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較做差值的獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 療效評價指標比較

患者療效評價指標比較見表1。治療前兩組患者3項得分經t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組患者治療前后3項指標得分經t檢驗，差異有統計學意義，治療后3項得分均低于治療前（P＜0.05），但組間比較顯示，觀察組患者治療后3項指標得分與對照組患者之間的差異有統計學意義，觀察組患者治療后3項指標得分低于對照組患者（P＜0.05）。

2.2 病變組織P16和CD34蛋白水平比較

治療前兩組患者兩種蛋白表達經t檢驗差異均無統計學意義（P＞0.05），兩組患者治療前后兩種蛋白表達經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），治療后兩組患者P16蛋白水平高于治療前，而CD34蛋白水平低于治療前（P＜0.05）。但組間比較顯示，觀察組患者治療后兩種蛋白表達與對照組患者之間的差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組患者治療后P16蛋白表達高于對照組患者，而CD34蛋白表達低于對照組患者。見表2。

表1 NNED患者療效評價指標比較 （n =40，±s）

表1 NNED患者療效評價指標比較 （n =40，±s）

外陰瘙癢評分 四度皮膚彈性評分 外陰白色病變面積/cm2治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 2.54±0.22 0.56±0.11 50.912 0.000 2.01±0.54 0.32±0.07 19.629 0.000 12.49±3.57 2.59±0.25 17.496 0.000對照組 2.55±0.25 1.02±0.23 28.485 0.00 2.07±0.36 0.91±0.05 20.185 0.000 12.35±3.32 5.68±1.02 12.146 0.000 t值 0.190 11.411 0.585 43.378 0.182 18.609 P值 0.850 0.000 0.561 0.000 0.856 0.000組別

表2 病變組織P16和CD34蛋白表達比較 （n =40，±s）

表2 病變組織P16和CD34蛋白表達比較 （n =40，±s）

CD34蛋白治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 63.29±2.94 86.30±2.40 38.345 0.000 158.39±8.94 119.32±6.04 22.903 0.000對照組 63.17±2.69 76.49±3.85 17.937 0.000 158.05±8.43 132.10±8.32 13.857 0.000 t值 0.190 13.676 0.175 7.862 P值 0.849 0.000 0.862 0.000 P16蛋白組別

2.3 治療相關不良反應

在治療過程中，兩組患者均分別出現1例（1/40，2.5%）外陰皮膚淺表性破潰及水泡，經對癥治療后均痊愈，其余患者均未出現不良反應。

3 討論

NNED是一種慢性頑固性病變，患者外陰真皮層出現局部微循環障礙，真皮層毛細血管閉塞，膠原蛋白生成受阻，造成真皮內細胞出現不同程度的退行性病變，進而導致黑色素細胞消失，細胞變性，皮膚褪色變白等種種臨床癥狀[9]。NNED不僅給患者身心帶來巨大負擔，且研究表明，NNED是外陰癌出現的高危因素，因此，及時有效的治療NNED十分必要。傳統治療NNED的方法包括藥物、物理和手術治療，但一直沒有療效穩定確切的標準治療方式。多數NNED患者經過治療依然出現病情反復或者疾病復發，導致患者病程長，增加患者心理和經濟負擔[10]。

超聲波組織穿透能力強、攜帶能高、局部定位性強，是臨床上用于治療NNED的標準手段，因此，在本研究對照組患者接受常規聚焦超聲治療。竹紅菌素可以在光照下被激活，具有抑菌可促循環作用，已有報道顯示將兩者合用可有效提高NNED的治療效果，本研究結果顯示，進行聚焦超聲治療的患者，1個療程后病變處皮膚組織外觀和瘙癢情況都得以極大的改善。這與HIFU的治療機制有很大關系，HIFU有很強的組織穿透性，通過將聲波能量聚集在較小的皮膚面積上形成高能量聲波，通過超聲波的熱效應來破壞病變組織，從而發揮治療作用[11]。HIFU可以通過破壞病變組織內部變性的毛細血管和神經末梢來促進正常組織細胞和毛細血管的生成，促進皮膚組織的修復和再生，從而改善皮膚瘙癢和色素改變的臨床癥狀[12]。與單獨接受HIFU的患者比較，接受聯合治療的患者1個療程后臨床癥狀改善更加明顯，這是由于竹紅菌素不僅具有較強的抑菌作用，還可以刺激局部皮膚的新陳代謝，增加微循環，從而有效加快皮膚再生和組織修復[13]。竹紅菌素的光化學機制主要含有I、Ⅱ型光動力學過程，兩種機制中光敏劑受光激發后產生活性氧（ROS），在有氧參與下，產生生物活性氧物質，如單重態氧、超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等。活性氧能氧化細胞中的生物大分子，如蛋白、脂肪酸及蛋白間的橋連結構，破壞生物分子的結構和功能，改變生物膜滲透性和流動性，激活或抑制膜上的酶蛋白和受體，最終引起細胞的凋亡與壞死，從而起到殺菌抑菌的作用。

NNED雖然是一種發生在外陰的良性病變，但也有一定的惡變概率，目前認為，NNED與細胞周期失調和微循環障礙有關。因此，筆者還對P16和CD34蛋白進行研究。P16蛋白是調節細胞分裂周期的關鍵蛋白，在控制細胞增殖的過程中發揮十分重要的生理功能。研究認為[14]，P16對維持細胞中抑癌基因Rb的活性狀態十分必要，通過與Cyclin依賴性激酶結合抑制原癌基因的活性，保證細胞增殖有序可控的進行。鐘麗君等[15]的研究表明，在病變組織中P16蛋白的表達高于健康組織和病變旁組織，提示，P16蛋白在組織中的表達可能與NNED患者預后有關。在本研究中測量病變皮膚組織治療前P16蛋白水平可以發現，兩組患者經過治療后P16蛋白水平均有所上升，提示再生的健康皮膚組織中P16蛋白含量也高于病變組織。CD34蛋白被認為是一種具有較高特異性的血管內皮細胞標志物，它在未成熟的血管內皮細胞中大量表達，通過對CD34蛋白的檢測，可以反映組織內部新血管生成情況[16]。在病變的皮膚組織中，CD34蛋白表達增加，提示局部組織血管的過度增生可能與NNED發病相關。這也與之前的研究相符，楊靜等[17]的研究認為在硬化性苔蘚型病變的組織當中，CD34表達增加。經過治療后的新生皮膚組織中，CD34蛋白表達趨于正常，也說明血管增生在NNED發病中可能起到關鍵作用。觀察組患者治療后P16蛋白水平更高而CD34蛋白水平更低可能與觀察組患者病變出新生組織再生速度更快有關，竹紅菌素對局部皮膚組織再生起到促進作用。

綜上所述，聚焦超聲聯合竹紅菌素軟膏治療NNED療效顯著，增加病變組織中P16蛋白含量，降低CD34蛋白含量，值得臨床推廣。