紫花苜蓿 MsUGT73B2基因的克隆及表達

尤 章，張 靖，任鵬輝，楊培志，呼天明

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

作為植物體最為重要的反應之一，糖基化修飾與植物蛋白或小分子物質的生物活性、溶解性、穩定性等生物學特性密切相關。在天然產物的生物合成、植物體激素平衡、植物體防御反應、亞細胞定位、外來化合物的生物脫毒及生物活性物質在液泡中儲存等方面具有重要作用。自然界中大多數的糖基化反應由糖基轉移酶介導，其由一個大的、發散的多基因家族構成[1]。糖基轉移酶被劃分為94個家族，其中家族1是最大的家族，并與植物的功能密切相關[2]。家族1的糖基轉移酶(UGT)都具有一個被稱為“植物次級產物糖基轉移酶盒”(PSPG BOX)的羧基末端共有序列，并以尿苷5′-二磷酸糖作為糖供體，因此被命名為UDP-葡糖基轉移酶(UGT)[3-5]。UGT的重組表達研究結果顯示其可以催化產生多種植物次級代謝產物，如糖苷、萜類、生物堿、酚類等。植物生長發育過程中許多生物過程需要UGT進行糖基化，特別是調控植物次生代謝[6-7]和植物體激素平衡[8]。糖基轉移酶不僅在植物糖基化過程中發揮作用，而且參與植物體對逆境的多種響應。擬南芥(Arabidopsis thaliana)家族1 UGT的一個子集已經得到功能性鑒定，其中一些參與逆境的適應。擬南芥AtUGT76B1(AT3G11340)在結合異亮氨酸方面起作用，它參與防御病原體感染[9]。AtUGT74E2(AT1G05680)以吲哚丁酸(IBA)作為基質，與水分脅迫抵抗有關[10]。另外，擬南芥AtUGT85A5(AT1G22370)在煙草(Nicotianatabacum)中的異源表達大大提高其對鹽脅迫的適應性[11]。 蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) GT99D基因參與合成花青素、黃酮類物質，可能參與逆境環境的響應[12]。

豆科植物體內黃酮、類黃酮類物質含量豐富。黃酮類天然產物在植物防御、共生、發育和授粉方面具有廣泛的活性[13-16]。黃酮類物質對于人類健康亦具有重要作用，包括預防心血管疾病和癌癥等[17]。黃酮類化合物和異黃酮類化合物在自然界中通常被發現為糖綴合物，其中糖基殘基可能對生物活性至關重要。糖基化作為植物體多種代謝物合成、修飾與運輸的最后一步，對于植物體生長發育至關重要，而糖基轉移酶作為糖基化的催化劑，對于底物糖基化尤為關鍵。紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬植物，具有重要的飼用價值，在草牧業發展中具有重要作用[18]，對其糖基轉移酶的研究鮮見報道。

本研究利用RACE-PCR技術克隆紫花苜蓿糖基轉移酶 MsUGT73B2基因，利用生物信息學、qRT-PCR等方法對其進行分析，為進一步研究紫花苜蓿糖基轉移酶基因功能，鑒定其是否在植物逆境脅迫中發揮重要作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.Baoding)、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)為試驗材料，均由西北農林科技大學草業科學系保存。

1.2 RNA提取和cDNA的反轉錄

以2周齡紫花苜蓿全株為提取RNA的材料，使用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取紫花苜蓿RNA，試驗步驟參照試劑盒說明書。利用第一鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)進行反轉錄，獲得紫花苜蓿cDNA模板，-20 ℃保存，備用。

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中間片段的克隆

根據NCBI數據庫中蒺藜苜蓿 MtGT99D基因序列，利用Primer 5.0軟件設計中間片段的上下游特異引物F-UGT、R-UGT(表1)，引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。使用55 ℃退火溫度進行PCR擴增，產物經膠回收后連接至pMD-19T(Simple)載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂板培養，挑取陽性克隆，菌檢后送上海生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果用Blast分析，篩選目的序列。

表1 中間片段引物Table 1 Primer of middle fragment

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中間片段的克隆

以“1.3”測序結果為模板，設計3′和5′末端擴增特異性引物3′GSP、5′GSP(表2)并合成。根據SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clonetech)試劑盒說明書，使用72 ℃退火溫度進行3′和5′末端擴增，產物膠回收后進行克隆及測序，得到紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全長序列，設計基因全長引物35S-UGT-F、UGT-EGFP-R(表2)，擴增基因全長片段。

表2 GSP和基因全長引物序列Table 2 Primer sequence of GSP and full-length gene

注：下劃線堿基表示EcoRⅠ酶切位點，斜體的堿基為15 bp同源序列，用于同源重組克隆。

Note:Underlined bases representEcoRⅠ restriction sites, and the italicized bases represent 15 bp homologous sequences for homologous recombination cloning.

1.5 生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0進行氨基酸序列同源比對，并構建系統發育樹；利用在線軟件ExPASY(https://www.expasy.org/)對基因編碼蛋白進行氨基酸序列分析，預測信號肽、二級結構、親疏水性等；利用SWISS-MODEL軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白三級結構，利用Wolf Psort軟件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位預測分析。

1.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表達分析

根據測序得到的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全長序列，利用IDT網站(https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)設計實時定量PCR(RT-qPCR)引物(表3)。以數據庫紫花苜蓿β-ActincDNA為內參基因[19]， 使用EvaGreen 2× qPCR MasterMix -No Dye試劑盒(ABM)，每個樣品3個重復，反應體系20 μL：10 μL qPCR MasterMix，正反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL；對水培30 d的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因在干旱、10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl處理下地上、地下部分的相對表達量進行檢測。采用2-ΔΔCt法分析基因mRNA的相對表達量。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequence of RT-qPCR

1.7 基因表達載體構建與亞細胞定位

將“1.4”得到的基因全長片段與EcoRⅠ切開的pCAMBIA1300-35S-EGFP載體使用同源重組酶構建重組載體pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP，重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆菌檢后測序，陽性克隆提取質粒轉化農桿菌GV3101，通過侵染煙草葉片觀察亞細胞定位。

1.8 數據分析

使用SPSS 17.0進行數據統計分析，使用Microsoft Excel 2016軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MsUGT73B2基因的克隆

以紫花苜蓿cDNA為模板，使用正反向引物F-UGT、R-UGT擴增得到長度968 bp的中間片段序列(圖1)，測序后經NCBI序列比對，發現其與蒺藜苜蓿 A17MtGT99D 基因具有較高相似性，證明擴增得到的紫花苜蓿基因序列可用。以3′GSP、5′GSP為引物擴增得到長度分別為821和1 186 bp的3′與5′端序列并進行拼接，得到基因全長序列(圖1)。利用全長引物35S-UGT-F和UGT-EGFP-R擴增得到長度為1 512 bp的基因全長序列(圖1)。最終擴增得到的基因全長序列與蒺藜苜蓿 A17MtGT99D基因相似性較高，表明所得序列是紫花苜蓿 MsUGT73B2基因序列。

由生物信息學分析可知，該基因編碼區長度為1 512 bp，編碼503個氨基酸(aa)，包括堿性氨基酸58個，酸性氨基酸73個；疏水氨基酸223個和極性氨基酸280個(圖2)。

圖1 MsUGT73B2基因擴增電泳檢測Fig.1 Electrophoresis pattern of MsUGT73B2 amplification

2.2 MsUGT73B2蛋白同源序列分析

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白序列與擬南芥、木豆、大豆、蒺藜苜蓿、葛根、地三葉、綠豆的UGT氨基酸序列同源比對結果如圖3所示，深藍色表示完全比對，即非常保守，其余顏色表示相對比較保守序列，未用顏色標記序列表示差異序列，顯示出不同的物種差異性。黑線表示PSPG BOX，PSPG BOX的起始氨基酸W和終止氨基酸Q具有很高的保守性。比對結果顯示，該蛋白屬于糖基轉移酶家族，與擬南芥相比，幾種豆科植物MsUGT73B2蛋白氨基酸序列同源性更高。氨基酸C端保守性較高，此與其蛋白家族功能相關，該家族蛋白C末端具有由44個氨基酸殘基組成的PSPG BOX功能結構域。氨基酸序列間具有一定的差異性，表明該蛋白在不同物種間具有序列差異性。

2.3 MsUGT73B2蛋白系統發育樹的構建

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白與其他10種植物UGT蛋白的系統發育樹結果如圖4所示，紫花苜蓿 MsUGT73B2基因所編碼的蛋白與蒺藜苜蓿位于同一分支，其序列同源性達93%，表明它們之間親緣關系最近，說明選取數據庫蒺藜苜蓿序列作為紫花苜蓿參考序列是可行的。豆科植物糖基轉移酶之間的同源性大于70%，遠高于擬南芥、野草莓、歐洲大葉楊和蘋果(僅43% 左右)，表明進化過程中豆科植物間出現分歧時間較晚。

圖2 MsUGT73B2基因全長CDS及編碼氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced protein sequence of MsUGT73B2

2.4 MsUGT73B2蛋白理化性質分析

對MsUGT73B2蛋白理化性質進行分析，結果顯示，分子式為C2552H3954N662O747S22，理論等電點為5.36，分子質量為56.6 ku，蛋白半衰期為30 h，該蛋白不穩定系數為40.15，屬于穩定性蛋白。如圖5所示，在第29個氨基酸殘基處取最大值2.122，在第272和273個氨基酸殘基處取最小值 -3.200，總平均疏水指數為 -0.234，屬于親水性蛋白。通過TMHMM軟件分析可知，MsUGT73B2蛋白不存在跨膜結構區域。利用SignalIP軟件對蛋白信號肽進行預測可知，該蛋白無信號肽區域。

2.5 MsUGT73B2蛋白二級結構及三級結構預測

對MsUGT73B2蛋白二級結構預測結果如圖6所示，在蛋白二級結構中，α-螺旋(Alpha helix)占 45.15%，不規則卷曲(Random coil)占36.18%，延伸鏈占15.90%，β-轉角占5.77%；N端和C端均以α-螺旋為主。以三萜烯糖苷轉移酶UGT71(PDB:2acv)為模型構造MsUGT73B2蛋白模型，MsUGT73B2蛋白與蛋白模型相似度為27.11%，同為UGT蛋白單體分子，N末端氨基酸序列由5個扭曲的β-片層和6個α-螺旋組成；C末端氨基酸序列包含6個α-螺旋與3個β-片層；第357位為色氨酸殘基，第400位為谷氨酰胺殘基，中間部分為PSPG BOX區域；C端與N端由一個柔性環連接，形成一個松散可變的深溝。

2.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表達分析

MsUGT73B2基因在紫花苜蓿根部和葉片中均有表達。 MsUGT73B2基因在葉片中的表達量顯著高于根部，為根部的5.85倍(P<0.05)(圖7)。干旱脅迫下，葉片中該基因的表達呈先升高后降低的趨勢，在2 h時達到最高值(上升67%)，后開始下降(4 h時，表達量低于0 h)；根部在干旱2 h時總體呈下降趨勢(圖8)。ABA處理下，該基因的表達模式與干旱表現出相似的趨勢，即葉片中表達量先升高后降低，在2 h時達到最高值，隨葉片中時間延長基因表達量持續降低；根部在2～4 h表達量略高于對照(0 h)，但并未出現顯著差異，4 h后基因表達水平顯著降低(圖9)。鹽處理時，在4 h之前葉片中基因的表達量顯著增加，4 h后快速下降，8 h時與對照相比降低70%；根部基因表達量在鹽處理下隨時間的延長持續降低，且在鹽脅迫初期具有顯著變化(圖10)。

圖3 UGT 家族氨基酸序列多重比對Fig.3 Multiple sequence alignment of UGT gene family

圖4 UGT基因系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree construction of UGT gene

圖5 蛋白親疏水性分析Fig.5 Distribution curve of hydropathy of protein

藍色為α-螺旋 Blue is alpha helix；紅色為延伸鏈 Red is extended strand；綠色為β-轉角 Green is beta turn；紫色為不規則卷曲 Purple is random coil

*表示差異顯著(P<0.05) * significantly different at level of P<0.05.

不同小寫字母表示紫花苜蓿同一部位不同處理時間的差異(P<0.05)。下同。

2.7 基因表達載體構建與蛋白亞細胞定位

MsUGT73B2蛋白亞細胞定位預測結果表明，由于不存在各種細胞器定位信號，預測該蛋白可能定位在細胞質中。將pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP表達載體注射煙草葉片進行亞細胞定位，結果如圖11所示，MsUGT73B2蛋白定位在細胞質中，與預測結果一致，表明 MsUGT73B2基因編碼的糖基轉移酶在細胞質中進行底物的糖基化。

圖9 MsUGT73B2基因對ABA處理的響應Fig.9 Response of MsUGT73B2 gene to ABA treatment

圖10 MsUGT73B2基因對鹽脅迫的響應Fig.10 Response of MsUGT73B2 gene to salt stress

圖11 MsUGT73B2基因亞細胞定位Fig.11 Subcellular localization of MsUGT73B2 Gene

3 討 論

植物糖基轉移酶在植物體代謝中發揮重要作用，紫花苜蓿糖基轉移酶對于其次生代謝調控、生長發育及逆境響應具有重要意義。本研究通過序列比對發現，糖基轉移酶C端相比于N端更保守。糖基轉移酶C端負責識別和結合糖基供體，N端負責識別與結合糖基受體[20]。C端PSPG BOX含有10個高度保守的氨基酸，可能與其UDP-糖的結合有關[21]。PSPG BOX的第一個氨基酸殘基W與最后一個氨基酸殘基Q具有高度保守性，W與UDP-糖基的結合相關[22]，Q則更利于結合葡萄糖苷[23]，因此MsUGT73B2蛋白更傾向于結合UDP-葡萄糖進行轉移。系統發育樹顯示，與擬南芥UGT73B2蛋白相似，具有UDP-葡糖基轉移酶活性、UDP-糖基轉移酶活性、黃酮醇3-O-葡糖基轉移酶活性、黃酮醇7-O-β-葡糖基轉移酶活性、槲皮素3-O-葡糖基轉移酶活性、槲皮素7-O-葡糖基轉移酶活性[24]。哺乳動物糖基轉移酶通常含有信號序列，可以進入內質網，并具有跨膜結構域和內質網滯留信號KEDL或HEDL，因此通常定位于內質網中[25]。通過對擬南芥糖基轉移酶分析，發現植物糖基轉移酶與哺乳動物定位不同，其糖基轉移酶定位于細胞質[26]，屬于一類細胞質酶。對該蛋白進行理化性質分析結果顯示其屬于不穩定的親水性蛋白分子，無信號肽與跨膜結構，與其定位于細胞質中相吻合。植物糖基轉移酶功能復雜，序列差異性較大，但其三維結構和反應機制并未發生巨大變化，因此通過同源建模可以有效地了解糖基轉移酶的三維結構[27]。同源建模結果顯示，MsUGT73B2蛋白屬于典型的GT-B構象，此與梭梭(Haloxylonammodendron)和刺五加(Eleutherococcussenticosus)UGT蛋白相似，都屬于GT-B構像蛋白[28-29]。GT-B構象為兩個正對的 β/α/β類Rossmann折疊區域，不需要二價金屬離子作為輔基保持活性[21]。

對 MsUGT73B2基因進行熒光定量RT-qPCR檢測，它主要在紫花苜蓿葉片中進行表達，此與蒺藜苜蓿 MtGT99D基因報道相符[30]。對 MsUGT73B2基因在干旱、鹽和ABA處理下進行基因表達分析，結果表明處理前期該基因在葉片中的表達呈上升趨勢，隨脅迫時間延長基因表達量逐漸降低，可在脅迫早期增加該基因的表達水平提高紫花苜蓿對于脅迫的響應能力。擬南芥中過表達 UGT73B2基因可以增強其對活性氧的抗性[31]。紫花苜蓿 MsUGT73B2基因是否在植物逆境脅迫中具有重要作用有待進一步驗證。

4 結 論

本研究克隆紫花苜蓿 MsUGT73B2基因，長度為1 512 bp，編碼503個氨基酸，編碼UGT家族蛋白，在細胞質中發揮底物催化功能。基因表達分析顯示，其主要在地上部分表達，且對于干旱、鹽和ABA脅迫的響應出現在脅迫早期。