接骨木鐮刀菌產孢培養基篩選

楊 波，郭成瑾，王喜剛，沈瑞清,

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.寧夏農林科學院 植物保護研究所，銀川 750002)

鐮刀菌屬(Fusarium)真菌是一類分布極其廣泛的真菌[1]，其中的許多種都能嚴重危害經濟作物。通過寄生植物維管束系統，損壞輸導組織，產生某些毒素，可造成作物重大損失，嚴重時顆粒無收[2]。如尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)可在油桐、西瓜、黃瓜等作物上引起一種毀滅性病害——枯萎病[3-5]；禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)可侵染小麥引起赤霉病[6-7]；燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)、尖孢鐮刀菌均可引起大蒜干腐病[8-9]；茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌等引起甘薯爛根病[10]；接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)、茄病鐮刀菌和銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)等是引起甘肅、黑龍江、內蒙古等地馬鈴薯干腐病的主要致病菌[11-13]。

接骨木鐮刀菌作為一種致病鐮刀菌，據有關報道，它不僅是引起國內外馬鈴薯病害的主要病原菌[14-15]，而且是中國甘肅[12]、河北、內蒙古[13]、黑龍江[11]及新疆[16]多個馬鈴薯主產區的優勢病原菌，造成嚴重的經濟損失。接骨木鐮刀菌在已知培養基上產孢量不大，因此，一種能夠促進接骨木鐮刀菌產生大量孢子的培養基在致病性等相關研究中至關重要。在篩選促進鐮刀菌產孢培養基的研究上，中國學者做了大量研究。李健等[17]研究結果表明，以狗尾草玉米淀粉培養基進行鐮刀菌培養，在菌落生長和分生孢子產孢量方面都顯著優于其他雜草培養基和日常真菌培養基；在對串珠鐮刀菌產孢培養基的研究中，中國學者研究表明，蠶豆葉培養基能夠促進串珠鐮刀菌產生大量的分生孢子[18]。有研究認為鐮刀菌屬許多種的分離菌株往往有產生豐富菌絲的趨勢而不形成孢子，接骨木鐮刀菌雖然能夠產生孢子，但其在PDA培養基上的產孢量往往達不到配制特定濃度孢子懸浮液的要求，且一般情況下接骨木鐮刀菌在合成培養基上生長時，生長和產孢能力都有一定程度的退化，理想的培養基仍然有待開發[1]。

本試驗選取8種常用鐮刀菌培養基[18-20]，通過菌落生長量和產孢量的測定，從中選出幾種較好的培養基，然后自配5種新的培養基觀察接骨木鐮刀菌的生長量和產孢量，篩選最佳培養基，為以后研究接骨木鐮刀菌提供一種理想培養基，方便科研工作者在研究中配制特定濃度的孢子懸浮液。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：N-34-1號菌株(2017年從采自寧夏西吉縣馬鈴薯‘青署9號’病薯上分離得到)，經形態學和分子學鑒定為接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)，現保存于寧夏農林科學院植物保護研究所實驗室。

常用培養基[19-21]：PSA培養基，VBC培養基，CMC培養基，麥粒培養基，CMA培養基，燕麥培養基，馬鈴薯牛肉膏培養基，PDA培養基。

自配培養基：WOA培養基，WLA培養基，OLA培養基，OSA培養基，LSA培養基(自配培養基配方見表1)。

表1 自配培養基的配方Table 1 The formulation of self-made media

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基對接骨木鐮刀菌菌落生長的影響 培養基配制好后分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，濕熱滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min后，倒入直徑8 cm的培養皿中，每種培養基倒3皿，每皿接入接骨木鐮刀菌的菌餅1塊(直徑5 mm)，放入恒溫培養箱中25.5 ℃恒溫培養，采用十字交叉法測量不同培養基培養不同時間的菌落直徑。

1.2.2 培養基對接骨木鐮刀菌產孢量的影響 培養基配制好后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，濕熱滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min后，倒入直徑8 cm的培養皿中，每種培養基倒3皿，每皿接入接骨木鐮刀菌的菌餅1塊(直徑5 mm)，放入恒溫培養箱中25.5 ℃恒溫培養，分別在培養1、3、5、7、9 d時用直徑為 5 mm 的打孔器在菌落上打菌餅，置于1 mL無菌水中制成孢子懸浮液，用血球計數板在顯微鏡下觀測孢子數。

1.2.3 自配培養基的混配方法 根據8種常用培養基菌落生長和產孢量的試驗結果，從中篩選出菌落生長快、產孢量大的培養基，將其進行兩兩減半自配，自配出5種新的培養基，依次命名為WOA、WLA、OLA、OSA和LSA培養基，再對5種自配培養基進行接骨木鐮刀菌生長量的測定。

1.3 數據處理

所有數據均采用Excel 2000 軟件進行整理，并通過SAS 8.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 常用培養基對接骨木鐮刀菌生長的影響

2.1.1 菌落生長 由表2可以看出，8種常用培養基對接骨木鐮刀菌菌落生長有一定影響。從測量的第2天開始菌落直徑逐漸變大，當培養至第8天時菌落直徑均達到最大值。其中PSA培養基上的菌落直徑增長最快，培養至第4天時PSA培養基上的菌落直徑為5.09 cm，比PDA培養基上菌落直徑增加22.40%；第8天時PSA培養基上接骨木鐮刀菌的菌落直徑比最小的PDA培養基增加26.84%。差異顯著性分析表明，培養到 4～8 d 時，PSA培養基上接骨木鐮刀菌的菌落直徑和其他7種培養基之間差異顯著。總體來看，綜合考慮菌落生長的4個時間段，PSA培養基相對于其他培養基接骨木鐮刀菌菌落生長最明顯。

表2 接骨木鐮刀菌在8種常用培養基上的菌落直徑Table 2 The diameter of colonies of Fusarium sambucinum on eight common used media

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05).The same below.

2.1.2 產孢量 由表3可知，隨著培養時間的增加，8種培養基上接骨木鐮刀菌的孢子量總體呈現上升趨勢。從第3天開始接骨木鐮刀菌的孢子量逐漸開始增加，除了PDA培養基以外的其他7種培養基均在觀察的第9天達到孢子量的最大值。其中麥粒培養基上的產孢量增長最快，培養至第3天時麥粒培養基上的孢子數比產孢量最少的燕麥和PSA培養基上的孢子量增加84.98%；當培養至產孢量最大的第9天時，麥粒培養基上的孢子量比PSA、VBC、CMC、CMA和PDA培養基上的孢子量分別增加64.67%、94.83%、91.36%、55.15%和89.65%。

差異顯著性分析表明，當培養到第3～7天時，麥粒培養基上的孢子量與其他幾種培養基之間差異顯著；培養至孢子量最大的第9天時，麥粒、燕麥和馬鈴薯牛肉膏3種培養基之間孢子量無顯著性差異，而與其余4種培養基差異顯著。總體來看，在接骨木鐮刀菌產孢的4個時間段內，與其他培養基相比較，麥粒培養基上產孢量的增幅最明顯，其次為馬鈴薯牛肉膏和燕麥培養基。

表3 接骨木鐮刀菌在8種常用培養基上的產孢量Table 3 Sporulation of Fusarium sambucinumon on eight common used media

2.2 自配培養基對接骨木鐮刀菌生長的影響

2.2.1 菌落生長 由表4可以看出，以常用培養基PDA為對照，5種自配培養基對菌落生長有一定的促進作用，生長速度均大于PDA培養基。隨著培養時間的增加，接骨木鐮刀菌在6種培養基上的菌落直徑也呈現遞增趨勢，當培養至第5天時菌落直徑達到最大值。其中WLA培養基上的菌落直徑增長最快，培養至1 d時，生長最快的WLA培養基比對照PDA培養基的菌落直徑增加 20.83%；培養至菌落直徑最大的第5天時，WLA培養基菌落直徑比對照PDA培養基上菌落直徑增加9.57%。差異顯著性分析表明，培養到第2～4天時，WLA培養基上的菌落直徑與其他5種培養基之間差異顯著；培養5 d時，WLA培養基與WOA、OSA、LSA和PDA培養基之間差異顯著。綜上所述，5種自配培養基中WLA培養基對接骨木鐮刀菌的菌落直徑影響最明顯，而其他4種之間差異不顯著，但培養效果都優于PDA培養基。

表4 接骨木鐮刀菌在5種自配培養基上的菌落直徑Table 4 The colony diameter of Fusarium sambucinum grown on five self-made media and control medium(PDA)

2.2.2 產孢量 自配培養基對接骨木鐮刀菌產孢量的影響見表5。結果表明，5種自配培養基和對照培養基上的產孢量隨時間的延長均呈現遞增的趨勢。從第3天開始，各個培養基上接骨木鐮刀菌的孢子量逐漸增加，在測量的第9天時孢子量達到最大值。其中孢子量增長最快的是WLA和OLA培養基，培養至第3天時，WLA和OLA培養基上的孢子量比對照PDA培養基分別增加84.53%和88.18%；第5天時產孢量最大的OLA培養基比對照PDA培養基增加88.81%；第7天時產孢量最大的WLA培養基比PDA培養基增加87.42%；當培養至第9天時，WLA培養基上接骨木鐮刀菌的產孢量則明顯高于其他幾種培養基，WLA培養基上的孢子量比WOA、OLA、OSA、LSA和PDA培養基分別增加78.96%、34.73%、88.49%、65.87%和90.68%。差異顯著性分析表明，培養到第9天時WLA培養基上的產孢量與其他5種培養基差異顯著。綜合考慮培養的幾個階段，從產孢量上考慮，WLA和OLA培養基對接骨木鐮刀菌的產孢量具有很好的促進作用，其中最好的是WLA培養基。

3 結論與討論

接骨木鐮刀菌在不同培養基上的菌落生長和產孢量存在明顯差異。試驗結果表明，新配的5種培養基中WLA為培養接骨木鐮刀菌的最適培養基，在菌落生長和產孢量上均優于其他幾種培養基。接骨木鐮刀菌是一種重要的致病鐮刀菌，目前關于接骨木鐮刀菌的研究主要集中在分離鑒定、拮抗菌及抑菌藥劑的篩選方面。魏巍等[13]在對河北和內蒙古馬鈴薯干腐病菌種類鑒定中發現，接骨木鐮刀菌是兩省的優勢種群，分離頻率分別為50.00%和87.95%。王愛軍等[22]和崔巖等[23]分別以萎縮芽胞桿菌(B.atrophaeus)和俄羅斯木霉(Trichodermarossicum)為研究對象，發現他們對接骨木鐮刀菌均有很好的拮抗作用。杜密茹等[24]在對馬鈴薯鐮刀菌干腐病殺菌劑防效研究中發現，好力克和世高的抑菌效果最好，對菌絲和孢子的抑制率均達100%。接骨木鐮刀菌產孢培養基的篩選研究至今尚未報道，而對于鐮刀菌其他種產孢培養基篩選的報道屢見不鮮，藍江林等[25]在對尖孢鐮刀菌非致病力菌株281進行培養基篩選試驗中發現，在選用的8種培養基中PDA和ATCC培養基在產孢量上優于其他幾種培養基。溫州民等[26]則在篩選促進禾谷鐮刀菌產孢培養基研究中發現，草汁瓊脂培養基能夠促進禾谷鐮刀菌產孢。

對于真菌培養基來說，碳、氮源和礦物質是基本組成物質，其中碳源的影響最大，氮源次之。通常情況下，在含有淀粉或者纖維素的基質上，可以促進孢子形成。本試驗最終得到WLA培養基對接骨木鐮刀菌菌落的生長及產孢量都優于其他培養基，而WLA培養基中馬鈴薯和麥粒中都含有大量的淀粉。據有關研究指出當用單糖做碳源時不利于真菌在培養基上產孢，董漢松等[27]研究認為PDA培養基并不總是給予真菌最大的產孢量與生長量，PDA培養基中所含的葡萄糖為單糖，而本試驗中自配培養基WLA所含麥芽糖是雙糖而非單糖，這就使得自配WLA培養基在生長量和產孢量上優于其他培養基。再輔以牛肉浸膏、水及瓊脂中提供的礦物質營養，對接骨木鐮刀菌的生長及大量產孢提供優異的環境，并且WLA培養基的配方簡單，所用原材料均易得，因此可作為培養接骨木鐮刀菌的理想培養基。

本試驗對接骨木鐮刀菌產孢培養基進行研究，效果很明確，但針對鐮刀菌屬真菌大量產孢的理想培養基，仍有待于在試驗和實踐中去尋找，雖然本試驗最終得到的WLA培養基能夠促進接骨木鐮刀菌的生長及大量產孢，但鐮刀菌屬真菌種類繁多，接骨木鐮刀菌只是其中之一，本試驗尚未明確用WLA培養基培養鐮刀菌屬真菌的其他種是否有像接骨木鐮刀菌一樣的培養效果，因此有待進一步的試驗與研究。