甘草中甘草酸的含量測定方法研究

徐 建，康慧芬，楊惠琳，張立忠

(1.寧夏寶塔化工中心實(shí)驗(yàn)室(有限公司)，寧夏 銀川 750001；2.寧夏寶塔石化科技實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司 ，寧夏 銀川 750001)

甘草是常用的中藥品種之一，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止痛、調(diào)和藥效的效果[1]。甘草的主要有效成分為甘草酸、甘草苷和異甘草素等[2]。經(jīng)藥理研究表明，甘草酸具有顯著的腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可以用于人體抗衰老、抗炎、降壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高生理機(jī)能的作用[3]。近年來，還用于病毒性肝炎的預(yù)防和治療癌癥以及艾滋病等[4]。本文采用超聲波提取法及高效液相色譜法對甘草中甘草酸的含量進(jìn)行測定，效果良好，為甘草的質(zhì)量研究和科學(xué)使用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：甘草酸單銨鹽(中國藥品生物制品檢定所)；原料：甘草(河北圣山生物科技有限公司)；試劑：乙醇、磷酸等，均為分析純；乙腈，色譜純；超純水。

1.2 主要儀器

U-3000型高效液相色譜儀(美國熱電儀器有限公司)；電子天平(天津市天馬儀器廠)；紫外-可見分光光度計(jì)(德國耶拿儀器公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸(38∶62)，檢測波長：252 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫為室溫；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，加70%乙醇溶液溶解并稀釋制成每1mL中約含甘草酸0.2mg的溶液，搖勻待用。

供試品溶液：精密稱定甘草粉末約0.2 g置具塞錐形瓶中，加入100mL 70%乙醇，密塞搖勻后稱定重量，超聲處理半小時(shí)后放冷再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量后搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液。

2 結(jié)果與分析

2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取對照品溶液10μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察甘草酸含量測定重復(fù)性，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性考察結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘草中甘草酸含量測定重復(fù)性良好。

2.2 檢測限

精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，加70%乙醇溶解并稀釋制成一定濃度的溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，使甘草酸主峰峰高約為基線噪音的3～5倍，以此濃度作為甘草酸含量測定的檢測限，結(jié)果見圖1。

圖1 方法檢測限色譜圖

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘草酸含量測定的檢測限為0.001μg/mL。

2.3 定量限

精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，加70%乙醇溶解并稀釋制成一定濃度的溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，使甘草酸主峰峰高約為基線噪音的10倍，以此濃度作為甘草酸含量測定的定量限，結(jié)果見圖2。

圖2 甘草酸含量測定方法學(xué)定量限色譜圖

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘草酸含量測定的定量限為0.003μg/mL。

2.4 線性相關(guān)性試驗(yàn)

稱量甘草酸單銨鹽對照品適量，加70%乙醇溶解并稀釋制成每1 mL中分別約含甘草酸50、100、150、200、250、300、350μg的線性溶液，吸取各線性溶液10μL，注入液相色譜儀，以濃度(C)為橫坐標(biāo)與峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

結(jié)果為：線性回歸方程：A = 0.07495C + 0.48776，R2=0.99993。由此可知，甘草酸在50～350μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)性。

2.5 穩(wěn)定性考察

精密量取新配制的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，每隔2h進(jìn)樣檢測一次，考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果

由試驗(yàn)可知，樣品12 h內(nèi)未見顯著變化，樣品穩(wěn)定性良好。

2.6 準(zhǔn)確度

精密稱量甘草酸單銨鹽適量，加70%乙醇溶解，稀釋成每1 mL中約含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液；取已知含量的甘草溶液，置10 mL量瓶中，配制9份，分別加入甘草酸單銨鹽對照品適量，加70%乙醇溶解配制成低、中、高三個(gè)濃度，搖勻，濾過，作為供試樣品溶液；精密量取上述各溶液10μL，注入液相色譜儀，考察方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘草中甘草酸含量測定方法準(zhǔn)確度良好。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

精密稱取甘草粉末6份各約0.2 g，置具塞錐形瓶中，加入100 mL 70%乙醇，密塞搖勻后稱定重量，超聲處理半小時(shí)，放冷后再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過取續(xù)濾液，平行配制6個(gè)樣品，測定含量，考察方法精密度，結(jié)果見表4。

表4 精密度考察結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，甘草酸精密度的RSD為0.26%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

3 結(jié)論

(1)以高效液相色譜法檢測甘草中甘草酸的含量。色譜條件為：色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸(38∶62)，檢測波長：252 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫為室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

(2)高效液相色譜法檢測甘草中甘草酸具有重復(fù)性好、檢出限低、線性相關(guān)性良好，受環(huán)境影響小、準(zhǔn)確度和精密度良好，操作簡單、測定迅速的特點(diǎn)。

(3)以確定的色譜條件對甘草中甘草酸進(jìn)行含量測定，通過外標(biāo)法計(jì)算甘草中的甘草酸含量為4.79%。該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，適用于測定甘草及其制劑產(chǎn)品中的甘草酸含量。