基于ITS和ISSR的羊肚菌種質資源遺傳多樣性分析

楊 燕，田 鴻*，張小平，毋校輝，羅金洲

(1.四川農業大學 資源學院，四川 成都 611130；2.四川菌之味農業科技有限公司，四川 成都 611130)

【研究意義】羊肚菌屬于子囊菌門(Ascomycota)，盤菌綱(Pezizomycetes)，盤菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)，是一種珍惜名貴的食用菌，具有較高的營養價值，被稱之為“菌中之王”，備受人們喜愛[1]。長久以來，市場主要以野生羊肚菌采集為主，隨著消費和認知水平的擴大，野生羊肚菌已經無法滿足市場需求，國內不少地區已出現野生羊肚菌產量明顯下降趨勢。可喜的是，在全球蘑菇愛好者和我國菇民朋友的不懈努力下，羊肚菌人工栽培取得了長足進展，特別是近年來發源自我國川渝地區的羊肚菌大田栽培技術，逐漸成熟并推廣至全國各地，實現了羊肚菌的商業化栽培[2]。羊肚菌馴化栽培道路艱辛而漫長的一個主要原因是可栽培菌株的確定。美國的工廠化栽培菌株為變紅羊肚菌，而適應于我國當前栽培模式的菌株主要是黑色羊肚菌支系種類[3]，主要為梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)，六妹羊肚菌(Morchellasextelata)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)[4]。種質資源研究匱乏、種性退化嚴重、同物異名和異物同名的現象[5]，這是制約我國羊肚菌穩步發展的主要原因。【前人研究進展】隨著分子生物學的發展，羊肚菌多基因序列模標數據庫MLST[6](Multilocus sequence typing)的開發，眾多分子標記技術廣泛應用于羊肚菌的分子鑒定。劉叢文利用核糖rDNA內部轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列指導鑒定羊肚菌所屬物種[7]。Kerry O’Donnell等[8]人利用28S rDNA-RPB1-RPB2-EF-1α多基因序列聯合分析羊肚菌系統發育，最后將羊肚菌分為三大支系：黑色羊肚菌支系(Elata,Clade)、黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)和變紅羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade), 杜習慧等[9]通過多基因序列研究中國羊肚菌，同樣將其分為以上三大支系，目前最具權威的分類體系。杜習慧等[10]利用羊肚菌交配型基因(Mating-Type locus,MAT)構建系統發育樹，能很好區分近緣物種，分析其親緣關系，對指導種質鑒定具有重要意義。目前商業化栽培的羊肚菌大部分是黑色羊肚菌支系，而黃色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系的羊肚菌未有成功商業化栽培的報道。學者們從各地采集野生羊肚菌，馴化人工栽培，鑒定羊肚菌所屬種類，這有利于選育適合人工栽培的菌株。 國內關于羊肚菌遺傳多樣性研究的報道較少，劉文叢[11]利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標記方法對滇西北地區56株羊肚菌子實體進行了遺傳多樣性及系統發育分析，結果表明，羊肚菌居群間的遺傳分化程度較大，而居群內的遺傳分化程度相對較小。羊肚菌物種豐富，杜習慧等[12]第一次進行了同區域2種羊肚菌種群間遺傳多樣性研究，結合分子標記手段表明兩者有明顯的變異性，表明兩個同源物種具有不同的潛在進化史。【本研究切入點】本研究以18株羊肚菌菌株(其中人工栽培菌株14株，菌株4株)為供試材料，結合形態學特征和ITS序列對供試菌株進行鑒定，并構建了供試菌株的系統發育關系。結合ISSR分子標記技術對其進行聚類分析，系統的對供試菌株間的種質資源進行分析。【擬解決的關鍵問題】本研究有助于羊肚菌遺傳育種工作的開展。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共計18株，具體信息見表1。

1.2 試劑與儀器

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。主要試劑：葡萄糖、瓊脂粉、瓊脂糖(北京奧博星生物技術有限責任公司)；真菌基因組DNA抽提試劑盒(Ezup)、PCR MIX、DNA凝膠回收試劑盒及DNA Marker DL 2000 bp均購自上海生工生物工程有限公司；ITS1、ITS4和ISSR引物，均由北京擎科新業生物技術有限公司合成。主要儀器：研缽、恒溫培養箱、渦旋振蕩器、冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

表1 供試菌株

1.3 菌種活化及DNA的提取

將羊肚菌菌絲塊接種至新鮮PDA平板上，于22 ℃恒溫培養，待菌絲長滿后備用。

取已經準備的羊肚菌菌絲體為材料，液氮研磨，按照真菌基因組DNA提取試劑盒上操作步驟提取供試菌株DNA。采用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，-20 ℃冰箱保持備用。

1.4 ITS基因PCR擴增

ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG； ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應體系(50 μl)如下：2×TaqMix 25 μl，真菌通用引物(10 μM)ITS1和ITS4各1 μl，模板DNA加1 μl，加入22 μl ddH2O補齊體系。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共計35個循環；循環結束后再72 ℃延伸10 min，反應結束。PCR產物于1.5 %的凝膠上電泳，電壓120 V，電泳20 min。用凝膠成像系統拍照并保存，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化的片段，將其于擎科生物技術有限公司(成都)完成測序。

1.5 ISSR-PCR擴增

參考劉文叢的文章[11]，經過篩選出條帶清晰、重復性和穩定性好且多肽條帶相對較多的引物用于羊肚菌遺傳多樣性分析，其引物ISSR1：AGAGAGAGAGAGAGAGC。ISSR-PCR擴增反應體系(30 μl)：2×TaqMix 15 μl，ISSR引物(10 μM)1.5 μl，模板DNA 3 μl，加入10.5 μl ddH2O補足體系。PCR程序：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，30個循環；循環結束后再65 ℃延伸16 min，反應結束。取5 μl PCR產物于2 %的凝膠上電泳，電壓80 V，電泳1.5 h。將凝膠移至凝膠成像儀下觀察并照相保存。

1.6 數據分析

登錄NCBI數據庫，將所測得的羊肚菌ITS序列進行BLAST比對，下載相似度高的序列，用MEGA6.0軟件進行系統發育分析，根據鄰近遺傳距離法(NJ法)構建系統發育樹[13]，對結果進行分類，結合形態特征分析，鑒定羊肚菌菌株。

ISSR標記的電泳圖中每1個條帶代表引物的1個特異結合位點人工讀取電泳條帶，有擴增條帶的為“1”，同一位置無條帶的為“0”，在EXCEL表中建立數據矩陣。采用NTSYS-pc2.1軟件計算樣品之間的相似系數，并進行UPGMA(非加權算術平均聚類)進行聚類分析[14]。

2 結果與分析

2.1 系統發育分析

我國目前的羊肚菌人工栽培菌株主要是梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌[16]，其中梯棱羊肚菌的推廣應用面積最大，野生梯棱羊肚菌主要集中在四川、云南、湖北、貴州等地。梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和高羊肚菌子實體形狀如圖1～3所示。

供試菌株的系統發育樹如圖4所示。9株來自不同地區的9株人工栽培菌株(YD9a、YD13、YD7、YD2、YD1、cang1、YD16、YD17、YD9b)和野生菌株GS(采自陜西)為梯棱羊肚菌。2株人工栽培菌株(12wen、1212M)為六妹羊肚菌；野生羊肚菌菌株1431B(采自成都大邑)、WL3(采自重慶武隆)和2株人工栽培菌株(cang2、YD6)為高羊肚菌(M.elata)。以上菌株均屬于黑色羊肚菌支系。而野生菌株LF(采自湖北恩施)和YD15(采自綿陽平武)為粗柄羊肚菌(M.crassipes)[15]，屬于黃色羊肚菌支系。

圖1 梯棱羊肚菌Fig.1 Morchella importuna

圖2 六妹羊肚菌Fig.2 Morchella sextelata

2.2 ISSR-PCR聚類分析

利用已經優化的羊肚菌ISSR-PCR擴增體系，對引物ISSR1進行擴增(圖5)，不同的菌株擴增出的條帶具有明顯的差異，且多態性豐富，重復性強。

2.3 供試菌株ISSR聚類分析

采用UPGMA法構建了羊肚菌菌株間聚類圖，如圖6所示，在相似系數0.54處可將18株羊肚菌分為2大類，即M1、M2、M9、M7、M12、M11、M8、M18、M10、M13、M6、M16、M5為1類；M3、M14、M4、M15、M17為1類。其中M7和M12相似系數高達99 %，兩者親緣關系最近；M1和M2相似系數高達95 %，M8和M18相似系數高達95 %，M6和M16相似系數高達95 %，他們之間遺傳關系比較近，而M1和M17遺傳關系最遠。

3 討 論

羊肚菌是一種名貴的食用菌，具有較高的營養價值。其鮮品可以直接進入消費市場，也可以做成干品，便于運輸和儲藏，其干品有種特殊的菌香味，深得消費者喜愛[17]。目前羊肚菌已經實現了人工栽培，不會再因為野生羊肚菌的稀缺而無法滿足消費者的需求，譚方河[18]闡述了羊肚菌栽培歷史，經過不斷探索，栽培技術已有了很大的進步。羊肚菌屬于子囊菌，遺傳特性不穩定，在栽培過程中，學者們開始意識到菌種在羊肚菌馴化及栽培中的重要性，羊肚菌菌株退化后，栽培將面臨絕收的可能，造成巨大的經濟損失[19-21]。目前解決羊肚菌菌種穩定性，主要從品種選育及馴化栽培，篩選出優良性狀的菌株，同時研究羊肚菌種質資源，生活史，菌種老化與退化，遺傳育種等基礎理論[22]。

圖3 高羊肚菌Fig.3 Morchella elata

加粗為供試菌株圖4 供試菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogeny tree constructed by the tested strains

圖5 18株羊肚菌擴增ISSR圖譜分析Fig.5 ISSR profile of 18 Morchella strains

圖6 供試菌株ISSR聚類分析Fig.6 Cluster analysis of tested strains based on ISSR

羊肚菌的生長易受到環境的影響，造成形態的多樣性，因此傳統的形態學分類法不能有效區分，分子生物學的發展，推動了分子標記法在菌株鑒定上的應用。閆曉雪等[23]基于ITS序列，對西南地區部分野生羊肚菌鑒定，將供試菌株分為7個種類。本項研究采用ITS分子標記手段結合形態特征對羊肚菌進行鑒定，以確定分類地位。結果表明，8個人工栽培菌株和1個野生菌株鑒定為梯棱羊肚菌，2株人工菌株鑒定為六妹羊肚菌，2株人工栽培菌株和2株野生菌株鑒定為高羊肚菌，2株野生菌株鑒定為粗柄羊肚菌。目前的栽培技術，梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌產量較高，已經商業化推廣，因此，在收集野生菌株的時候，可以有目的的選擇梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌進行馴化，這樣選育出商業化品種成功的可能性更大，豐富栽培品種，解決羊肚菌退化及老化問題，促使羊肚菌行業穩定發展。

近年來，由于全球氣候變化太大，加之人們過渡采集及不合理采集野生羊肚菌，其產量正逐年下降，為使羊肚菌資源得到可持續發展，需充分了解其物種遺傳多樣性。物種多樣性越豐富，對環境變化的適應能力越強，生存能力和進化潛力也就越大，進而也就不容易成為瀕危物種[24]。ISSR分子標記技術廣泛用于食用菌遺傳多樣性，不同的羊肚菌菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR 擴增過程中，DNA序列與引物結合，不同的菌株出現不同的ISSR條帶，能反映出菌株間的遺傳多樣性。魏巍等[14]選擇了16個羊肚菌菌株，應用ISSR-PCR技術討論了遺傳多樣性。本文對18株羊肚菌采用ISSR分子標記方法，其供試菌株的電泳圖譜具有明顯的差異性，多態性豐富，重復性高。采用UPGMA法對羊肚菌聚類分析，結果表明相似系數小于0.52時，供試菌株聚為一類，相似系數為0.54時，聚為兩大類，說明18株羊肚菌具有明顯的遺傳多樣性，在9個人工栽培梯棱羊肚菌菌株中，其中M1和M17遺傳差異最大，可能是由于它們生長條件、生長方式和生長階段的不同導致，推測環境的影響對羊肚菌遺傳的變化有很大關系。

4 小 結

綜上所述，本文采用ITS和ISSR分子技術對18株羊肚菌進行系統發育和遺傳多樣性分析，結果表明，供試菌株鑒定為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、高羊肚菌、粗柄羊肚菌，18個菌株具有明顯的遺傳多樣性。我國蘊含豐富的羊肚菌種質資源，可為人工馴化栽培和菌種選育提供大量素材，有利于羊肚菌產業長遠發展。