甜高粱在鎘脅迫下的生理生化和應答機理研究進展

李建鋼 劉瑞媛 彭丹妮， 李文建 董喜存 馬建忠

（1. 蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730000；2. 中國科學院近代物理研究所，蘭州 730030）

隨著全球工業化的發展，能源、信息和材料在技術和產業結構上已經達到了巔峰，伴隨而來的是能源匱乏和環境惡化［1］。研究顯示，預計2020年全球70%的能源來自石油，其余的30%為天然氣和新能源。如何降低石油在能源中的比例，以及增加新能源的產出備受關注［2］。冶金、采礦、化肥和農藥的使用都會帶來環境污染，在環境污染中尤其以重金屬污染最為嚴重［3］。重金屬污染是指密度由5或5以上的金屬及金屬化合物引起的污染，常見的引起環境污染的重金屬有鎘、鉛、鉻、汞、鎳、銅、鋅和錳等［4］。

重金屬污染不僅會降低土壤的生長性能，也可通過食物鏈進入動物體中，降低動物的生產性能。因此，修復重金屬污染的土壤極其關鍵。常規的土壤污染修復因其對土壤破壞力大，價格昂貴等逐漸退出了人們的視線。

生物修復是一種新型的土壤污染修復技術，因其成本低廉，對土壤破壞力小，安全性高、可進行原位實施等在最近幾年受到了越來越多的關注［5］。通常用于生物修復的植物有印度芥菜（Brassica junceaL.）、天藍遏藍菜（Thlaspi caerulescens）、向日葵（Helianthus annuus）、柳樹（Salix babylonica）和楊樹（Populus）等［6］。研究表明，用于重金屬污染修復的超富集植物往往具有植株矮小、生長速度慢及生物量小等缺點［7-8］。近年來，高生物量植物尤其是綠色能源植物，越來越多的用于重金屬污染土壤的修復。

甜高粱是國際公認的能源植物，與其他能源植物相比，甜高粱除了具有抗逆、抗旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿等特性外，還具有生長快、生物產量高、易收割及機械化操作簡單等優勢［9］。

甜高粱龐大的根系對土壤中重金屬有很強的吸收作用，是重金屬吸收和儲存的主要器官，Pb和Cd等重金屬主要儲存在根中。因此，利用高粱對重金屬富集能力和轉移能力，可以吸收土壤中的重金屬，達到修復土壤的目的［10］。植物對重金屬抗性的獲得有避性與耐性兩種途徑，耐性又具有兩條基本途徑：排斥與富集，排斥機制中，植物通過減少根系吸收和向地上部運輸來降低重金屬含量；富集機制則是重金屬在植物體內以不具生物活性的大分子形式存在［11-12］。

甜高粱對不同重金屬吸收能力存在較大差異。研究表明，甜高粱對汞（Hydrargyrum，Hg）、鎘（Cadmium，Cd）、錳（Manganese，Mn）、鋅（Zinc，Zn）和鎳（Nickel，Ni）的吸收作用顯著，但對鈷（Cobalt，Co）、鉻（Chromium，Cr）、鉛（Lead，Pb）和銅（Copper，Cu）的吸收作用相比其他作物不是特別顯著［13］。甜高粱對Hg、Cd、Zn、Mn和Ni的吸收隨著土壤中重金屬的含量高低而變化，土壤中較高的含量有利于甜高粱的吸收和在植株中的積累，可能是這幾種重金屬在甜高粱根內較易向地上部分轉移，將其富集在葉片和莖稈中；甜高粱對土壤中Co、Cr、Pb和Cu的吸收與土壤中的重金屬含量關系較小，大部分被集中在植物的根部，甜高粱對這幾種重金屬的吸收和積累達到一定量后就不再增加，向地上部分的轉移受到限制。可見，對重金屬的耐性機理主要是排斥機制，對這幾種重金屬沒有吸收和積累作用，而是靠根的滲透壓及維管束的輸送功能進入植株內［14-15］。

目前國內綜述大多闡述甜高粱對鎘的吸收、積累和轉運或鎘脅迫下甜高粱的生理生化機理，而對于整個過程的報道相對較少。

本文綜述甜高粱在重金屬鎘脅迫下的生理生化機制，其中生理生化機制主要是萌發率、抗氧化酶活性、光合速率、葉片超微結構、微量元素吸收的變化。而甜高粱對重金屬鎘的耐受性及分子機理。耐受性主要是的外排、螯和及液泡區室化。分子機理主要依賴谷胱甘肽途徑的調節，晚期胚胎豐富蛋白和自然抗性相關巨噬蛋白的表達。此外，甜高粱對重金屬鎘的吸收積累和轉運相關的蛋白，將甜高粱用于重金屬污染土壤的生物修復和生物質產能結合起來。

1 甜高粱

甜高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］起源于干旱、炎熱、土壤貧瘠的非洲大陸，是全世界廣泛栽培的作物品種，抗旱、耐撈、耐鹽堿、生物質資源豐富，并且是太陽能轉換效率最高的作物之一，水分利用效率最高的作物之一，是一種理想的生物能源作物［16］。甜高粱生物量大，株高可達2-5 m，每公頃可收獲3-6 t的種子，45-75 t的秸稈，莖稈糖錘度一般為16%-22%，可產糖約6-9 t，秸稈用于發酵生產生物乙醇，既可以解決能源危機，也可以將土壤中的重金屬轉移到植物中，避免了植物中的重金屬難以處理而造成的二次污染［17］。此外，甜高粱還具有生育周期短，可在一年內收獲2季，甚至3季。適合邊際性土壤的種植，機械化操作簡單等優勢。

2 甜高粱在鎘脅迫下的生理生化機制

2.1 重金屬鎘對種子萌發和幼苗的影響

種子萌發是種子經過吸脹作用吸水，貯藏物水解并運輸到生長部位的過程。鎘脅迫下甜高粱種子的萌發率降低可能是由于植物細胞中的核酸合成的減少［18］。An等［19］的研究表明種子的萌發率對鎘的毒性不敏感。更進一步的研究表明高粱可以耐受0.5 mmol/L的鎘，當鎘濃度大于3 mmol/L時種子萌發會受到不可逆的影響，而幼苗則會出現生長停滯的現象［20］。劉大林等［21］的研究結果與Kuriakose等［20］類似，低濃度的鎘促進高粱的生長，高濃度的鎘明顯抑制生長。丁氏清茶比較了兩個甜高粱品系，低濃度鎘可以促進幼苗的生長，當鎘濃度大于25 mg/kg抑制幼苗的生長，主要表現為株高明顯降低［22］。總結以上研究結果，低濃度鎘不但刺激種子的萌發而且促進幼苗的生長，高濃度抑制種子的萌發和幼苗的生長。

2.2 重金屬鎘對抗氧化酶活的影響

植物在遭受重金屬鎘脅迫時會產生活性氧，如O-2、H2O2和OH-等，抗氧化酶主要負責清除植物體內過多的自由基，發揮清道夫的功能［23］。劉大林的研究表明，輕度鎘脅迫主要是超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）發揮抗氧化功能，中度鎘脅迫主要依靠過氧化氫酶（Catalase，CAT）進行抗氧化應答，然而高濃度鎘脅迫由谷胱甘肽（Glutathione，GSH）來進行抗氧化應答。外源施加谷胱甘肽可以降低鎘對植物的毒效應，施加硫可以降低鎘對甜高粱根系的毒效應，提高POD的活性［24-26］。

2.3 重金屬對光合參數的影響

在重金屬鎘脅迫下，植物的光合速率顯著降低。劉大林研究顯示鎘濃度與葉綠素合成呈正相關，Soudek等［27］證明莖中的重金屬鎘導致葉綠素a/葉綠素b（Chl a / b，Chlorophyll a/Chlorophyll b）比例增加，丁氏清茶的研究結果與上述類似［22-24］。丁氏清茶發現低濃度鎘對凈光合速率（Net photosynthesis rate，Pn）沒有影響，高濃度鎘可明顯降低其值。高濃度鎘導致葉綠素含量損失，并最終導致葉片的萎黃。鎘脅迫降低葉綠素含量，損傷光合系統，減少二氧化碳（Carbondioxide，CO2）的吸收，干擾氣孔的開放。因此降低了植物的光合速率［27］，增加了胞間CO2濃度。這可能是由于重金屬與呼吸作用相關的酶結合，導致呼吸作用降低，積累了更多的CO2，最終導致胞間CO2濃度的升高，蒸騰速率對不同濃度的鎘不敏感。

2.4 重金屬鎘對超微結構的影響

在植物毒性癥狀表現出來之前，亞細胞水平已經有明顯的變化。葉綠體雙層膜結構消失，內囊體散亂，隨著受害程度的加劇，核糖體消失，核仁核膜解體。在電鏡下發現，鎘濃度在一定范圍內，刺激根毛的生長，超出臨界值根毛密度降低［20］。鎘可以使葉肉細胞內的淀粉粒變大，葉綠體變得狹長，葉綠體內的基粒片層膜排列紊亂，最終導致細胞壁增厚［28］。引起基粒片層膜上的酶的數量減少，這也是引起光合速率下降的一個原因。根尖內皮層細胞變成了鐮刀狀，后生木質部數量明顯下降［29］。這是因為根的發育方式是內始式，最先成熟的是原生木質部；其次是后生木質部。這些結果表明鎘可以延遲根的發育。

2.5 鎘對微量元素吸收的的影響

微量元素是植物需要量極少，但對于植物的生長發育必不可少一類元素。重金屬鎘脅迫影響甜高粱對于微量元素的吸收。0.5 mmol/L處理可以顯著增加甜高粱根對鐵和銅的吸收，根對鋅和錳的吸收沒有顯著變化，莖中的鋅和錳含量降低。在莖和根中鈣的含量均增加，然而鎂吸收會降低［24］。

3 甜高粱對重金屬鎘的耐受性及分子機理

通常植物對重金屬鎘的耐受分為細胞內部耐受和外排機理，植物通過外排機理排出鎘，避免了鎘在細胞內的積累。而內部耐受機制主要是鎘離子與有機配體的結合，形成鎘-植物螯合素大分子，緩解了鎘對植物的毒效應。

3.1 外排機理（轉運：從胞內到胞外的轉運）

通過根際進入植物細胞的重金屬經細胞膜轉運蛋白排出細胞，降低了重金屬對植物細胞的毒性。常見的重金屬外排蛋白有黃色條狀蛋白（Yellow stripe 1-like，YSL）、重金屬 ATP酶 4（Heavy metal atpase 4，HMA4）、植物鎘抗性蛋白1（Plant Cadmium Resistance 1，PCR1）、 植 物 鎘 抗 性 蛋 白 2（Plant Cadmium Resistance 2，PCR2）和多效性耐藥性蛋白8（Pleiotropic drug resistance 8，PDR8）［30-31］。

3.2 重金屬的螯合

進入細胞膜的重金屬首先與高親和力的配體螯合胞質中的金屬如氨基酸、有機酸、植物螯合素和金屬硫蛋白。螯合金屬離子的氨基酸和有機酸包括組氨酸、半胱氨酸、煙草胺（Nicotinamide，NA）、檸檬酸和蘋果酸，所有這些在金屬耐受性中發揮重要作用［32］。

目前，最常見的植物螯合素是一種生物小分子，谷胱甘肽和植物螯合劑，谷胱甘肽不僅是一種植物螯合劑，而且具有抗氧化、抗還原和促進植物生長發育的功能。還原性的谷胱甘肽是植物螯合劑的合成前體，在鎘和其他重金屬的脅迫下，與植物鰲合劑結合形成復合體，然后運輸進入液泡，積累在液泡中，降低了重金屬的毒性，增加了植物的耐受性［33］。

3.3 液泡區室化重金屬

液泡區室化是指進入細胞質的重金屬，經過液泡膜轉運蛋白進入液泡中，在液泡中完成重金屬的解毒。或者進入細胞質的重金屬與植物螯合劑結合形成復合物，經液泡膜特定的轉運蛋白進入植物液泡，區室化隔離，液泡區室化是植物體內重金屬穩態的關鍵［34］。復合物的轉運它依賴于液泡膜轉運蛋白，重金屬進入液泡依賴兩種轉運蛋白液泡氫離子ATP轉運體（Vacuolar H+transporting ATPase，V-AT-Pase）和液泡 H+無機焦磷酸酶轉運體（Vacuolar H+transporting inorganic pyrophosphatase，V-PPase），非重金屬富集植物液泡區室化主要在根細胞，然而重金屬超積累植物液泡區室化在葉片細胞中完成［35-36］。

3.4 耐受性分子機理

目前為止，植物對鎘耐受性的分子機理研究主要集中在模式植物擬南芥、小麥和水稻中，對甜高粱的研究較少。陳建等［37］構建了擬南芥β-甘露聚 糖 酶（XVE system-induced cadmium-tolerance 1，xcd1-D）突變體，超表達可以增加擬南芥對鎘的耐受性，進一步的研究表明鎘的耐受性增加依賴于谷胱甘肽途徑的調節，這一結論與在甜高粱和楊樹中外源施加谷胱甘肽可增加鎘的耐受性結論類似［37-38］。晚期胚胎豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）參與植物生長發育的不同階段，可以增加植物對不良環境的適應能力［39］，在水稻中超表達該基因可以增加水稻對重金屬的耐受性［40］。

近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展，尤其是轉錄組學、功能基因組學和蛋白組學的興起，為揭示甜高粱耐鎘的分子機理提供了可能。李銀心比較了96個甜高粱品系對鎘的吸收積累轉運能力，并選擇了高抗鎘品系（H18）和低抗鎘品系（L69）進行轉錄組學比較，甜高粱自然抗性相關的巨噬蛋 白 5（Sorghum bicolor natural resistance associated macrophage protein5，SbNramp5）基因的表達分別上調4倍和1.5倍。這一結果與之前大麥中自然抗性相關的巨噬蛋白5（Hordeum vulgare natural resistance associated macrophage protein5，HvNramp5） 基因的功能類似，盡管它表現出對鎘、錳的轉運能力，但其表達不受鎘的影響［41-42］。最近對Nramp5基因的研究是在秈稻中，利用CRISPR/Cas9敲除秈稻自然抗性相關的巨噬蛋白5（Oryza sativanatural resistance associated macrophage protein5，OsNramp5）基因，顯著降低了秈稻根和莖中的鎘含量，而不影響秈稻產量。更進一步驗證了Nramp5是秈稻鎘轉運的特異性基因［43］。韓國忠北大學的研究人員分別用100μmol/L和150 μmol/L處理10 d大小的甜高粱幼苗，利用二維凝膠電泳技術，出現了33個差異表達的蛋白，它們參與了碳固定，ATP合成、蛋白質的合成過程，但是關于甜高粱耐受鎘的分子機理還需要進一步的探索［44］。

雖然，一些植物已經用進化多種途徑來吸收Cd的策略，但調控Cd耐受的機制還不完全清楚［45］。

4 甜高粱對鎘的吸收、積累和轉運機理

4.1 甜高粱對重金屬鎘的吸收和積累

植物對重金屬鎘的吸收主要分為以下幾步：重金屬富集在根際周圍，從而吸附到根際表面；重金屬通過細胞膜進入到根細胞；進入根細胞的重金屬被固定在液泡中；胞間移動的重金屬通過細胞膜進入到木質部；重金屬從木質部轉運進入地上部分［46］。

通過根際進入植物的重金屬主要積累在植物的根中，但是會有一部分鎘通過木質部裝載進入韌皮部，運輸進入莖和葉。Soudek等［27］研究表明：鎘和鋅的積累主要是在甜高粱植物的根中。外源施加谷胱甘肽可以增加鎘在根中的積累同時也可以提高莖中的鎘濃度。丁氏清茶比較了兩個品系對鎘的積累順序為：根部＞莖部＞老葉片＞新葉片＞種子，鎘優先積累在低節間，越往上鎘積累量越少［22］。植物對不同重金屬的積累能力大小存在差異。能源草對不同重金屬在莖中的積累順序：Zn＞Cd～Cu＞Ni＞Pb［47］。 外 源施加乙二胺 四 乙 酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）可以增加植物的生長參數和銅的轉運效率，但是并不能夠增加銅在植物體內的積累［48］。

4.2 重金屬鎘的轉運

重金屬從根到莖的轉運，或者從木質部到韌皮部的轉運主要有兩種途徑，質外體途徑和共質體途徑，鎘積累的代謝阻遏物處理或低溫條件下只有質外體途徑轉運，常溫下既可以進行質外體轉運，也可以進行共質體轉運。共質體轉運需要借助細胞膜上的轉運蛋白，常見的胞膜重金屬轉運蛋白分為兩類（圖1）。

第一類為鋅鐵離子轉運蛋白（Zinc-regulated transporter and iron-regulated transporter protein，ZIP），可以轉運 Zn2+、Cd2+、Fe2+和 Mn2+二價陽離子［49］。

第二類細胞膜轉運蛋白為Nramp轉運家族，可以轉運 Zn2+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和 Co2+［43，50］。

圖1 植物對重金屬的轉運

進入植物根際細胞的重金屬，一部分進入液泡，液泡區室化完成重金屬的解毒。另外的一部分重金屬裝載進入木質部，完成從地下部分（根）到地上部分的轉運。參與木質部裝載的蛋白主要分為以下幾類：

第一類YSL蛋白轉運家族，主要轉運在細胞質中與尼克酰胺結合的金屬陽離子，包括Ni2+、Fe2+、Fe3+。最近在水稻中的研究：OsYSL9可以轉運NAFe2+和 Fe3+脫氧麥根酸進入維管組織［31，51］。

第二類HMA4，屬于P型三磷酸腺苷酶（P1BATPase）家族成員，在擬南芥中該家族有8個成員AtHMA1-AtHMA8，它們的結構、功能各不相同，但都與重金屬的轉運和穩態相關。HMA4主要功能是轉運鎘和鋅進入木質部［52］。

第三類PCR1/2，在擬南芥中的研究表明PCR2參與鋅的再分配和解毒，在pcr2突變體的根中可以積累更多的鋅，超表達則會降低鋅在根中的積累。PCR2主要定位于表皮細胞和幼根的木質部，而在高度分化的表皮細胞的根部表達。然而，擬南芥中的研究結果顯示AtPCR1參與鈣的轉運［53-54］。

5 甜高粱用于重金屬污染土壤的修復

土壤重金屬污染越來越嚴重，隨著科學技術的的發展和時代的進步，常規的土壤污染修復技術因其成本高昂、對土壤破壞力大等逐漸退出了人們的視線。生物修復是利用植或作物對環境中的重金屬進行吸附的一種新型的土壤污染修復技術。其優點對土壤破壞力小，原位實施，可以大規模進行修復。將甜高粱用于生物修復，汁液發酵生產生物乙醇，廢棄的秸稈可以燃燒發電，從灰分中收集重金屬鎘，不僅能解決能源危機，而且能修復環境（圖2）。本文綜述了近年來重金屬脅迫對甜高粱的生理生化、甜高粱對重金屬的耐受性分子機理、以及甜高粱重金屬的吸收積累轉運能力。為后期甜高粱在重金屬污染地區的修復奠定基礎，引領環境修復行業向綠色可持續發展的方向邁進。

圖2 甜高粱用于重金屬鎘污染土壤的修復

6 展望與討論

隨著重金屬鎘污染土地面積的日益擴大和鎘中毒事件的頻繁發生，修復鎘污染的土壤勢在必行。深入研究甜高粱對鎘的吸收積累轉運機理顯得極其重要；另一方面，闡明鎘超積累植物的耐性與解毒機制，可以分離并克隆鎘超積累的功能基因，培育高效的修復植物，為鎘污染土壤的修復提供理想材料。為實現以上目標，還需從以下幾個方面進行深入探討。

6.1 甜高粱對鎘的轉運能力的研究

目前來說甜高粱對鎘的吸收能力因品種的不同而存在較大的差異，雖然已經篩選出了吸鎘能力較強的甜高粱品種，但甜高粱對鎘的轉運能力相對較差。因此，培育高效轉運鎘的甜高粱，仍然需要我們共同的努力。

6.2 甜高粱遺傳轉化體系的建立

小麥、水稻已經建立了一套完整的遺傳轉化體系，甜高粱遺傳轉化體系并未完全建立，即使利用土壤農桿菌可以進行遺傳轉化，但遺傳轉化率很低。因此，完善高粱的遺傳轉化體系，為培育高效修復鎘污土壤的甜高粱具有現實意義。

6.3 廢棄秸稈的處理

含有重金屬鎘的甜高粱，汁液可以用來發酵生產生物乙醇，廢棄的秸稈可以燃燒發電，從灰分中收集重金屬鎘，防止秸稈中鎘對環境的二次污染。

6.4 發酵車間的利用效率

甜高粱汁液用來發酵生產生物乙醇，但由于北方甜高粱的成熟期集中在9-10月，其他月份車間處于停滯狀態，因此，發酵車間利用效率很低。

6.5 結合其它修復技術

生物修復雖有成本低廉，可進行原位修復等優點。但通常只適用于中低濃度重金屬污染的土壤修復，因此可以結合其他修復技術綜合修復。這樣，不僅可以降低對土壤的破壞力，而且可以改良土壤的生長性能。