響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草蛋白超聲波輔助提取工藝及其營養(yǎng)評價

侯若琳 劉鑫 項凱凱 陳磊 鄭明鋒 傅俊生

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蛹蟲草（Cordyceps militarisL. Link），又名北冬蟲夏草、北蟲草等，屬于子囊菌門、核菌綱、麥角菌科、蟲草屬［1］，它是一種珍貴的食藥用真菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值［2］。研究表明蛹蟲草含有許多活性成分，如蟲草素、多糖、蟲草酸、麥角甾醇、甘露醇和蛋白質(zhì)［3-7］等。目前蛹蟲草相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)主要集中在利用蟲草素、腺苷、多糖等活性成分，而對于其蛋白質(zhì)的提取性研究報道及市場上針對蛹蟲草蛋白進(jìn)行研究開發(fā)的產(chǎn)品卻并不多見。蛋白質(zhì)作為蛹蟲草的主要成分之一，約占蟲草干重的30%，研究證實它具有許多生物學(xué)活性，Qing等［8］研究表明蛹蟲草蛋白可以抑制小鼠4T1腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草蛋白中的纖溶酶可以預(yù)防血栓的形成。隨著蛹蟲草蛋白研究不斷的深入，諸多的生物活性將逐漸被揭示，用途也將日益廣泛，加強(qiáng)蛹蟲草蛋白提取方法研究對于蛹蟲草蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要經(jīng)濟(jì)價值。

常規(guī)的蛋白質(zhì)堿法提取工藝提取時間長、提取溫度高、提取效率低、容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性等缺點，而超聲波輔助提取法具有提取時間短、提取效率高、環(huán)境污染小和成本低等優(yōu)點，但超聲時間過長、溫度過高會破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白活性喪失［10-13］。為避免超聲時間過長而破壞蛹蟲草蛋白的活性，本實驗首先將蛹蟲草子實體粉末超聲一段時間，使蛹蟲草細(xì)胞壁破碎后，停止超聲，繼續(xù)攪拌提取，使蛋白進(jìn)一步溶出，提高蛋白提取效率，并進(jìn)一步對所提取蛋白的氨基酸組成與營養(yǎng)價值進(jìn)行了分析，為蛹蟲草蛋白營養(yǎng)保健食品的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛹蟲草子實體 購于福建省古田縣；BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 KH3200B型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；85-1型恒溫磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；ST 20型pH計：美國奧豪斯公司；K 9840型凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司；ST16R型離心機(jī)：美國Thermo公司；Agilent1100液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白含量測定 參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)測定-食品中蛋白質(zhì)的測定》中第一法進(jìn)行測定分析［14］，經(jīng)過測定蟲草子實體的蛋白含量為28.88 g/100 g。

1.2.2 提取蛋白含量測定 采用BCA法測定，取20μL一定濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中，再加入180 μL的BCA工作液，充分混勻后置于37℃孵育30 min，冷卻到室溫，在562 nm處檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)上述同樣方法測定蛋白提取液吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中蛋白濃度。

1.2.3 蛹蟲草蛋白的提取 精確稱取干燥蛹蟲草子實體粉末1.00 g溶于不同pH和料液比的緩沖溶液中→25℃超聲提取→關(guān)閉超聲后繼續(xù)攪拌提?。ㄒ陨暇唧w方法細(xì)節(jié)見1.2.4）→6 000 r/min 離心10 min→用BCA法檢測上清液蛋白的含量→上清液調(diào)節(jié)至蟲草蛋白的等電點（pH=4）→7 000 r/min離心10min→棄上清，沉淀用去離子水復(fù)溶→調(diào)節(jié)pH至中性→冷凍干燥得到蛹蟲草蛋白粉。

1.2.4 單因素實驗 分別考察超聲時間、pH、料液比、攪拌提取溫度和攪拌提取時間對蟲草蛋白提取率的影響，以蛋白提取率為指標(biāo)（表1）。

表1 單因素試驗因素與水平

1.2.5 響應(yīng)面因素的確定 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Desig-expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行實驗設(shè)計，優(yōu)化超聲波輔助提取蛹蟲草蛋白工藝。

1.2.6 提取蛋白氨基酸組成與營養(yǎng)價值評價 參照于海燕等［15］的方法進(jìn)行測定。樣品前處理：稱取0.2 g樣品于密封瓶中，加入10 mL 6 mol/L HCl（含1%苯酚），充氮氣1 min，封瓶，110℃水解22 h。取出冷卻，定容至10 mL，90℃下氮吹揮干，0.01mol/L HCl溶解定容，過0.45 μm濾膜測定。檢測條件：采用安捷倫公司自動在線柱前衍生化方法，一級氨基酸與鄰苯二甲醛（OPA）、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯（FMOC）衍生后過柱檢測。色譜條件：AAA-C18色譜柱（4.6×150 mm，3.5 μL）；檢測信號：紫外338 nm，熒光（EX=266 nm，EM=305 nm）；流動相A：40 mmol/L磷酸二氫鈉（pH7.8）；流動相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10，采用梯度洗脫方式（表2）。采用氨基酸評分（AAS）來評價蛋白質(zhì)氨基酸的營養(yǎng)價值。

表2 HPLC洗脫條件

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0和Desig-expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理和分析。采用t檢驗分析兩組之間的差異。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草蛋白提取單因素試驗

2.1.1 超聲時間對蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、攪拌提取溫度25℃、攪拌提取時間2 h的條件下，超聲時間分別為10 min、20min、30 min、40 min，研究超聲時間對蛋白提取率的影響。超聲時間越長，有利于細(xì)胞壁的破碎和蛋白的溶出，但超過30 min時，蛋白提取率基本不變，因此選取超聲30 min為超聲輔助提取蛹蟲草蛋白的最佳超聲時間（圖1-A）。

2.1.2 攪拌提取溫度對蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、超聲30 min、攪拌提取時間2 h的條件下，攪拌提取溫度分別為25℃、35℃、45℃、55℃，研究提取攪拌溫度對蛋白提取率的影響。蛹蟲草蛋白提取率隨著攪拌提取溫度的升高呈增加趨勢，當(dāng)溫度提升至35℃后，提取率變化不大；提取溫度過高，可能會導(dǎo)致蛋白的活性下降，同時加大能源的消耗，因此選取35℃為超聲輔助提取蛹蟲草蛋白的最佳攪拌提取溫度（圖1-B）。

2.1.3 攪拌提取時間對蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、超聲時間30 min、提取溫度35℃的條件下，攪拌提取時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，研究攪拌提取時間對蛋白提取率的影響。當(dāng)攪拌提取時間超過1 h時，提取率隨時間延長而降低（圖1-C），這可能是由于提取時間過長，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可溶性蛋白含量下降，同時也會加大能源的消耗，所以本實驗在攪拌提取時間為1 h的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.1.4 pH對蛹蟲草蛋白提取率的影響 在料液比1∶40、超聲時間30 min、提取溫度35℃、攪拌提取時間1 h的條件下，pH分別為6.5、7.5、8.5、9.5，研究pH對蛋白提取率的影響。提取率隨著pH的增加先升高后降低，并且pH過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和水解，活性降低（圖1-D），所以本實驗在pH為8.5的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.1.5 料液比對蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、超聲時間30 min、攪拌提取溫度35℃、攪拌提取時間1 h的條件下，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，研究料液比對蛋白提取率的影響。蛹蟲草蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的升高成增加趨勢，但超過1∶40時，增加緩慢（圖1-E）；考慮到料液比過大會造成溶劑浪費并且不利于后處理，所以本實驗在料液比為1∶40的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，超聲時間為30 min，攪拌提取溫度為35℃對蛹蟲草蛋白的提取最佳，從提取率出發(fā)，選定超聲時間為30 min，攪拌提取溫度為35℃的前提下，采用Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計，以A（pH）、B（料液比）和C（攪拌提取時間）為自變量，以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗（表3）。

圖1 各單因素對蛹蟲草蛋白質(zhì)提取率的影響

表3 Box-Behnken試驗因素與水平

通過Desig-expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對表4所列結(jié)果進(jìn)行分析，得到A（pH）、B（料液比）、C（攪拌提取時間）3個因素與Y之間的回歸方程：Y=82.87 +3.09 A + 2.28 B +0.84C-15.59A2+ 1.04B2-2.00C2-1.00 AB-0.18AC-0.69 BC；對回歸模型進(jìn)行方差分析，該模型的p＜0.0001，說明該模型具有高度的顯著性；失擬項P=0.272 2，失擬不顯著，說明回歸方程的擬合程度較好；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，表明模型實際值與預(yù)測值擬合較好，可解釋蛋白提取率響應(yīng)值的變化，可利用該回歸方程較好的分析和與預(yù)測最佳提取條件。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗證

通過對上述試驗結(jié)果的分析，可以預(yù)測最優(yōu)提取條件及提取率，由回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知（表5），模型的一次項A、B影響極顯著（P≤0.01），C影響顯著（P≤0.05），二次項A2、C2影響極顯著（P≤0.01），B2影響顯著（P≤0.05），交互項AB影響顯著（P≤0.05）；根據(jù)一次項系數(shù)的絕對值可知，各因素對蛹蟲草蛋白提取率的影響主次順序為pH＞料液比＞攪拌提取時間。根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制響應(yīng)曲面，以確定pH、料液比、攪拌提取時間對蛋白提取率的影響（圖2）。對回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，可求得極值點，即A=0.067，B=1.0，C=0.034，用Desigexpert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)模型預(yù)測，最優(yōu)反應(yīng)條件為：pH8.57、料液比1∶50、攪拌提取時間72 min，在最優(yōu)提取條件下，蛋白提取率可達(dá)86.26%。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

為進(jìn)一步驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)（pH8.57、料液比1∶50、反應(yīng)時間72 min）進(jìn)行驗證試驗，在此條件下重復(fù)3次實驗，3次實驗提取率的平均值為85.6%，與理論預(yù)測值的相對誤差在± 0.77%內(nèi)，由此可知，模型預(yù)測值和實際值之間有較好的擬合性，能夠較好的反映不同條件下蛋白提取率的變化。

表5 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

2.4 超聲波輔助取組與不超聲組對比

為了驗證超聲波對蛹蟲草蛋白提取的促進(jìn)作用，實驗設(shè)置了一組不超聲的對照。結(jié)果（表6）表明超聲波輔助提取比不超聲的對照組的蛋白質(zhì)提取率提高了34.75%，這是因為超聲波可以產(chǎn)生強(qiáng)烈振動、空化效應(yīng)和攪拌作用來破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白更易溶出。

表6 超聲波輔助提取與不超聲對照組提取率對比

圖2 響應(yīng)面法立體分析圖

2.5 提取蛋白氨基酸組成及營養(yǎng)價值評價

超聲波輔助提取法所提取的蛹蟲草蛋白含有17種氨基酸（色氨酸未測），含有7種人體必需氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA /TAA為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA /NEAA為79.84，均大FAO/WHO的推薦值40%和60%；除賴氨酸、蛋氨酸+胱氨酸低于世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和糧農(nóng)組織（The Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）標(biāo)準(zhǔn)模式，其余必需氨基酸均與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式相當(dāng)（表7），表明蛹蟲草蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值。

表7 提取蛹蟲草蛋白氨基酸成分及營養(yǎng)價值評價

3 討論

響應(yīng)面法是一組用于探索和優(yōu)化過程參數(shù)的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法。它使用一個簡單的方程來定義測試變量如何影響結(jié)果，并探索變量之間的相互關(guān)系。本實驗將超聲波輔助提取技術(shù)和響應(yīng)面法相結(jié)合來優(yōu)化蛹蟲草蛋白提取工藝參數(shù)，得到了最佳提取工藝參數(shù)，并且采用超聲波輔助提取方法比不超聲的對照組的蛋白質(zhì)提取率提高了34.75%，表明該方法是一種有效的蛹蟲草蛋白提取方式。

實驗進(jìn)一步對最優(yōu)條件下所提蛹蟲草蛋白氨基酸組成與營養(yǎng)價值進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示所提取的蛹蟲草蛋白含有豐富的氨基酸，其中谷氨酸含量最高（10.35%），其次是天門冬氨酸（9.20%）。谷氨酸在人體內(nèi)可促進(jìn)氮基丁酸的合成，從而降低血氨，促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸，可以用于治療神經(jīng)精神疾病，如精神分裂癥和腦血管障礙等引起的記憶和語言障礙、小兒智力不全等。天門冬氨酸是一種良好的營養(yǎng)增補(bǔ)劑，可用于治療心臟病、肝臟病、高血壓癥，具有防止和恢復(fù)疲勞的作用［17］。蛹蟲草蛋白必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA /NEAA為79.84%，均大FAO/WHO的推薦值40%和60%，表明所提蛹蟲草蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值，該研究為蛹蟲草蛋白營養(yǎng)保健食品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

蛹蟲草蛋白超聲波輔助提取的最優(yōu)條件為：料液比1∶50、pH=8.57，150 W功率下超聲30 min，然后關(guān)閉超聲波，置于35℃條件下繼續(xù)攪拌提取72 min，此條件下蛋白質(zhì)提取率達(dá)到85.6%，是不超聲對照組蛋白提取率的1.68倍，與模型預(yù)測值相對誤差為±0.77%。所提取的蛹蟲草蛋白含必需氨基酸占總氨基酸的比值為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為79.84%，均大于世界糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織的推薦值。