少棘蜈蚣抗菌肽Scolopin 2-NH2的抗菌作用機制研究

盧佳 鄧秋萍 任文華

（南京師范大學生命科學學院，南京 210046）

瑞典科學家Boman在研究巨型蠶蛾Hyalophora cecropia滯育蛹的誘導型防御系統時，發現了具有抗菌活性的多肽即抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）［1］，隨后科學家相繼在微生物、昆蟲、植物和人體中發現了抗菌肽［2］。目前已發現 2 600多種抗菌肽［3］，廣泛分布于病毒、細菌、真菌及各類動物體內?？咕膶儆诳股氐囊粋€新的家族，可作為常規抗生素治療藥物，也可與抗生素協調發揮作用。研究表明，兩種或幾種抗菌肽、抑或抗菌肽與傳統抗生素聯用，可以拓寬抗生素的抗菌譜乃至增強治療效果［4］。它不僅可以作用于細菌、真菌，對病毒和癌細胞也有抑制作用，具有廣譜的抗菌活性［5］。此外，抗菌肽還可以有效地殺滅引起人類及動物寄生蟲病（如瘧疾、氏病、菜什曼病等）的寄生蟲，并且具有抗精子作用、神經毒性、調節細菌以及在LDS或LPS協同作用下，增強人和鼠巨噬細胞產生呼吸爆發等生物學功能。

與傳統抗生素相比，抗菌肽的抗菌作用主要有以下幾個特點：（1）抗菌譜廣：對革蘭氏陰性菌［6-7］、革蘭氏陽性菌、革蘭氏兼性菌和真菌［7-9］都有高效的殺菌作用；（2）作用專一：原核細胞，腫瘤細胞與正常細胞的細胞膜結構不同，可以選擇性地作用于原核細胞和癌細胞，而對正常細胞幾乎無作用；（3）殺菌快速：大多數抗菌肽都可在5 min內引起菌類細胞的死亡；（4）不易產生抗藥性：對抗菌肽的抗藥性起決定性作用的因素系其疏水性和兩親性，而非肽鏈長度和所攜電荷數，這種特殊的作用機制使得致病菌很難產生抗藥性或交叉抗性［10］；（5）不易蓄積中毒；（6）無致畸作用。

目前，公認的抗菌肽的作用機制有兩種：膜作用機制，即破壞細胞膜，造成膜穿孔；非膜作用機制，又可分為細胞外機制和細胞內機制，細胞外機制主要指抗菌肽抑制細胞壁合成、激活自溶素或磷脂酶而發生溶菌作用［11］，細胞內機制則與干擾真核生物線粒體功能的發揮，影響核糖體合成蛋白質，影響基因的轉錄、表達和調控有關。陳旋等［12］研究了抗菌肽P7對大腸桿菌的非膜作用機制發現，抗菌肽P7可造成DNA的損傷，使DNA復制相關基因下調、DNA損傷修復基因上調，抑制DNA的復制和RNA的合成。

人類許多疾病的治療得益于抗生素的發現和臨床使用，但近40年以來，新型抗生素僅發現了3種［13］，而隨著抗生素的濫用，耐藥細菌感染已成威脅人類健康的一大隱患?？咕目咕钚愿?、抗菌譜廣［14］、種類多、不易引發細菌的耐藥性及對宿主無毒性或毒性小等特征，使其有望開發為新型的抗菌藥物。天然抗菌肽經過人工改造可降低細胞毒性、增強抗菌性和穩定性，對實現大規模生產進而造福人類具有重要意義［15］。以腸道菌群和抗菌肽間的相互作用為基礎，通過監測抗菌肽表達水平的方式建立起的一種疾病預防和診斷治療的輔助手段，可用來預估機體腸道的健康狀態［16］。此外，抗菌肽在防控動物疫病、增強動物機體免疫水平和抗氧化能力、提高動物生產性能等方面也具有廣闊的開發利用前景［17］。

蜈蚣（Centipede）是地球上最古老的捕食動物之一，屬于節肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科蟲體。據《神農本草經》所載，蜈蚣具有熄風止痙，通絡止痛和攻毒散結的作用，而且在治療癌癥、肝炎、腦血管病及多種皮膚病等均有明顯的療效。研究發現，少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）的毒液具有多種生化和生理作用［18-19］。Peng等［20］從少棘蜈蚣毒液中分離得到兩種抗菌肽，命名為Scolopin 1 和 Scolopin 2。其中，Scolopin 2經酰胺化修飾獲得的Scolopin-2-NH2（S-2-N），具有比其母體肽Scolopin-2（S-2）更強的抗菌活性，但對抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌機理尚未知曉。因此，本論文對抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌活性、理化性質進行了研究，并從細胞水平和分子水平對其抗菌機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌肽及菌種 抗菌肽：Scolopin-2（S-2）：GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH；Scolopin-2-NH2（S-2-N）：GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSHNH2；均由吉爾生化（上海）有限公司合成，自動多肽合成儀 APEX396，通過 HPLC 液相色譜進行脫鹽、純化，分子量測定采用快原子轟擊質譜法，純度≥95%。菌種：大腸桿菌（E.coliK12D31）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（salmonella）和枯草桿菌（Bacillus subtilis）均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 抗生素Kan+、Amp+購自Amresco公司；AnnexinV-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒購于南京 Vazyme 公司；DAPI 染色液購于美國Sigma 公司；DNA Marker、蛋白質Marker、通用型基因組DNA提取試劑盒（MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0）和逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit） 購 于 TaKaRa 生 物 公 司 ；SYBR?Premix Ex TaqTMII染料購于南京羅氏生物公司；RNA提取試劑盒（TranZolTMUp Plus RNA Kit，ER501）購于南京TransGen Biotech公司；細胞周期試劑盒（KGA512）購于凱基生物公司。

1.1.3 儀器 ELx800型酶聯免疫檢測儀（美國BLO-TEK公司）、320-SpH計（Mettler Toledo公司）、圓二色譜儀（英國Chirascan，Applied Photophysics）、流式細胞儀（美國BD公司）、PTC-200 PCR儀（美國MJ Research公司）、核酸與蛋白分析儀（美國NanoDropND-1000），StepOnePlusTMReal-Time PCR System（美國 AB生物系統公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽Scolopin-2-NH2的抗菌活性及理化性質

1.2.1.1 抗菌肽的抗菌活性及最小抑菌濃度 配置LB培養基，pH調至7.0。分別將凍存的4種菌（大腸桿菌K12D31、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌）按 1∶100 接種到液體 LB 培養基中，搖床培養過夜。

將固體 LB 培養基融化并冷卻至 55℃左右，按1∶100 加入菌液并搖勻，倒入滅菌平板培養皿，9 mL /皿，置于超凈工作臺內冷卻至凝固。用滅菌的打孔器在帶菌的固體 LB平板上打孔，孔徑為 8 mm，分別加入20 μmol/L抗菌肽S-2/S-2-N于瓊脂孔內，置于37℃培養10 h，拍照。

按最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）測定法檢測抗菌肽S-2/S-2-N對4種菌株（大腸桿菌K12D31、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌）的抗菌活性，酶標儀測定OD值，與初始OD值相比，OD值尚未顯著變化的最小濃度定義為此抗菌肽對該菌的最小抑菌濃度。

1.2.1.2 抗菌肽的理化性質 以圓二色譜儀檢測抗菌肽的二級結構，數據用Orign 8軟件處理作圖。

檢測抗菌肽的熱穩定性、酸堿穩定性、離子強度穩定性及對消化酶的不敏感性。將抗菌肽樣品分別經下述條件處理：溫度（100℃水浴0 min、5 min、10 min、20 min、30 min）、pH磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 梯 度 為 1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 和 12.0）、NaCl、KCl、CaCl2（離子濃度分別為 0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L）、胰蛋白酶和胃蛋白酶（37℃處理0 min、30 min和60 min），加入帶菌（E.coliK12D31）的LB平板瓊脂孔里，37℃培養 10 h，量取抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌肽Scolopin-2-NH2對細菌細胞膜的影響

1.2.2.1 抗菌肽在細菌細胞內的定位 熒光標記S-2/S-2-N。將活化的E.coliK12D31培養至對數生長期（105），5 000 r/min離心5 min收集菌液；PBS洗3次后加入FITC-S-2/S-2-N（10 μmol/L）37℃避光培養 30 min和1 h；PBS洗3次，5 000 r/min，離心5 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.2 觀察細菌超微結構、分析細胞膜完整性及抗菌肽的穿膜效率 將活化的E.coliK12D31培養至對數生長期（OD=0.5），離心收集菌液，加入抗菌肽S-2/S-2-N（20 μmol/L）37℃培養 30 min和 2 h，陰性對照為PBS；以此為材料制備超薄切片，透射電鏡下觀察細菌超微結構。

在帶有抗菌肽的E.coliK12D31中加入PI溶液，用流式細胞儀檢測PI著染陽性細菌數。用流式細胞儀檢測FITC-S-2/S-2-N處理后的E.coliK12D31著染的陽性細菌數。

1.2.3 抗菌肽Scolopin-2-NH2對細菌DNA和RNA的作用研究

1.2.3.1 細菌基因組DNA、總RNA含量的檢測 酶標儀測定經S-2/S-2-N處理的E.coliK12D31的基因組DNA和RNA的熒光強度。重復3次，取平均值。

1.2.3.2 抗菌肽與細菌DNA/RNA的凝膠阻滯分析 參照試劑盒提取法提取E.coliK12D31基因組DNA。分別用S-2/S-2-N溶于DNA binding buffer并作梯度稀釋，加入到細菌DNA溶液中，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像觀察拍照。同上法進行抗菌肽與細菌RNA的凝膠阻滯分析。

1.2.3.3 抗菌肽結合DNA后的結構變化 在E.coliK12D31基因組DNA中加入S-2/S-2-N，制成樣品。圓二色譜儀掃描，每個樣品連續掃描3次，取平均值；數據用Orign 8軟件處理。

1.2.3.4 抗菌肽對細菌細胞周期及細菌DNA復制與修復相關基因表達的影響 將活化的E.coliK12D31培養至對數生長期，加入S-2/S-2-N，37℃分別培養0.5h后，加入PI染色液，流式細胞儀檢測。

取上述培養菌體進行總RNA提取，逆轉錄反應體系合成cDNA（表1）。

用羅氏Green qPCR Master Mix 試劑盒對dnaA、dnaB、dnaG、SSB、RecA和RecN基因進行RT-PCR分析。按表3加入20 μL RT-PCR反應體系所需的各種試劑于八聯管中。引物序列如表2所示，進行RT-PCR。

1.2.3.5 統計分析 所有的實驗至少重復3次。采用SPSS18.0統計軟件分析處理，采用t檢驗，數據以平均值±標準差（x-±s）表示，（*）P＜0.05為具有顯著差異。

表1 cDNA合成反應體系

2 結果

2.1 抗菌肽Scolopin-2-NH2的抗菌活性及理化性質

2.1.1 抗菌活性檢測及最小抑菌濃度（MIC）兩種抗菌肽的最小抑菌濃度（MIC）見表4?？梢钥闯鲺０坊揎椀腁MP-S-2-N的抑菌活性明顯強于其母肽AMP-S-2，且二者對E.coliK12D31的抑菌效果最佳，故可選擇大腸桿菌作為抗菌敏感菌株。

表2 RT-PCR引物序列

2.1.2 抗菌肽的理化性質 圓二色譜技術探究抗菌肽S-2/S-2-N的二級結構，如圖1顯示的，二者均在197 nm處有一個負峰，說明具有一個無規則卷曲結構。AMP-S-2的峰值為-15.52，而AMP-S-2-N的峰值為-12.60，負峰值降低，即峰有所上移，這可能與S-2-N比S-2具有更強的抗菌活性有關。

表3 Real-time PCR反應體系

表4 抗菌肽的最小抑菌濃度

圖1 抗菌肽二級結構預測

如圖2-A所示，沸水浴5、10、20 min后，S-2/S-2-N仍具有較好的抗菌活性，30 min后抑菌圈直徑有所減小。說明抗菌肽對高溫具有較強的耐受性，僅在溫度超過30 min時，抑菌能力才有所下降。

如圖2-B，pH為 1、3、5、10、12時與pH為7時的抑菌圈大小無明顯差別。這暗示了AMP-S-2/S-2-N 具有酸堿耐受性。

如圖2-C（S-2）和2-D（S-2-N）顯示，除了Ca2+對AMP-S-2-N有輕微的抑制作用外，不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2離子對抗菌肽的抑制作用不明顯。說明抗菌肽對Na+和K+離子的耐受力較強，而Ca2+可能對其抗菌活性有一定的影響。

抗菌肽經胰蛋白酶和胃蛋白酶37℃酶切處理后，由圖2-E（胰蛋白酶處理）與圖2-F（胃蛋白酶）發現，處理60 min的實驗組抑菌圈直徑大小與陰性對照組沒有明顯變化，表明AMP-S-2/S-2-N對這兩種消化酶具有一定的耐受力。

2.2 抗菌肽Scolopin-2-NH2對細菌細胞膜的影響

2.2.1 抗菌肽在細菌細胞內的定位 如圖3所示，經FITC-S-2/S-2-N處理后的細胞均帶有熒光，說明S-2/S-2-N已完全進入細胞質內；細胞形態沒有發生變化，說明S-2/S-2-N的作用靶點應位于細胞質內。處理2 h后，觀察到抗菌肽進入的細胞數增多，且經S-2-N處理后的細胞有少量細胞碎片。

2.2.2 觀察細菌超微結構、分析細胞膜完整性及抗菌肽的穿膜效率 如圖4，AMP-S-2/S-2-N處理20min后，E.coliK12D31細胞膜邊緣出現輕微的模糊，細菌的形態還比較完整；2 h后，S-2處理的細胞的細胞膜開始破裂，內容物開始釋放出來，但形態還可以看清；而經S-2-N處理的細胞內容物泄露呈彌散狀，整個細胞已基本瓦解破裂。因此推斷，AMPS-2-/S-2-N作用細菌2 h后導致細胞質膜的破裂。

如圖 5 所示，處理20 min后，10 μmol/L S-2使PI著染陽性細胞比例為4.10%，而經10 μmol/L S-2-N處理后染陽性細胞比例為4.96%。當處理濃度增大到20 μmol/L時，陽性細胞數分別為7.48%和8.82%?？紤]到背景干擾，這樣的結果暗示了S-2/S-2-N對細菌胞膜有輕微的破壞作用，雖然在MIC時，S-2/S-2-N并沒有破壞細胞膜，影響質膜的完整性，但濃度增大破壞性增強，且S-2-N對細胞膜的擾動總比S-2強一些。

如圖6所示，經10 μmol/L的S-2/S-2-N處理20 min后，有41.28%的大腸桿菌細胞被S-2侵入，而S-2-N則為43.05%，均高于PBS陰性對照組（0.08%）；當S-2-N濃度為20 μmol/L時，同樣處理20 min，陽性細胞比例為54.97%高于S-2（44.83%）。以上結果暗示了S-2-N穿透E.coliK12D31細胞膜的效率比親本（S-2）高，這可能也是酰胺化的S-2-N比其親本抗菌活性強的原因之一。

圖2 抗菌肽的穩定性

2.3 抗菌肽Scolopin-2-NH2對細菌DNA和RNA的作用研究

2.3.1 細菌基因組DNA、總RNA含量的檢測 如圖7顯示，S-2/S-2-N分別作用5 h后，與對照組相比，S-2-N組DNA合成量減少了36%（P＜0.05），而S-2組為22%；RNA合成量也減少了33%，而S-2組為20%。結果表明S-2/S-2-N均可抑制大腸桿菌核酸的合成，且S-2-N抑菌能力強于母體肽S-2。

2.3.2 抗菌肽與細菌DNA/RNA的凝膠阻滯分析 通過凝膠阻滯實驗發現，AMP-S-2/S-2-N與基因組DNA具有很強的結合力。如圖8所示，當S-2濃度為10.4 μmol/L時，即開始出現阻滯現象，當濃度達到13.0 μmol/L時，S-2與NDA已經強烈結合，使DNA無法跑出點樣孔，即已被完全阻滯。而當S-2-N為10.4 μmol/L時，已經將DNA阻滯在點樣孔里，隨著濃度的增大，S-2-N與DNA結合的程度使得gold view已經無法插入到DNA的堿基對中，使得點樣孔中的DNA沒有發出熒光。以上現象暗示了這兩個抗菌肽中，至少S-2-N，與DNA結合的方式可能與gold view插入DNA的方式類似。實驗結果不僅說明了AMP-S-2/S-2-N能與DNA強烈結合，而且S-2-N結合DNA的能力比S-2強。

圖3 激光共聚焦觀察 FITC-S-2/S-2-N處理過的大腸桿菌細胞

圖4 大腸桿菌經S-2/S-2-N處理后的電鏡圖

圖5 流式細胞儀分析PI流入抗菌肽處理的大腸桿菌細胞的結果

在抗菌肽與RNA的凝膠阻滯實驗中，如圖9所示（圖中拖尾現象可能是在提取過程中RNA部分降解，但主條帶仍保持完好），S-2/S-2-N可與RNA強烈結合，當S-2為15.6 μmol/L時，RNA就出現了阻滯現象，當濃度達到62.5 μmol/L時已基本被阻滯在點樣孔里；對S-2-N來說，濃度為7.8 μmol/L時，就開始有明顯的阻滯現象，當濃度大于15.6 μmol/L時，RNA已經完全跑不出點樣孔。實驗結果說明S-2-N結合RNA的能力比S-2強。

圖6 流式細胞儀分析FITC-抗菌肽流入大腸桿菌細胞的結果

圖7 S-2/S-2-N對大腸桿菌核酸合成的影響

2.3.3 抗菌肽結合DNA后的結構變化 如圖10所示，在DNA的CD譜中，270 nm的正峰是由于堿基堆積作用產生的，240 nm的負峰則對應DNA的雙螺旋結構的B型構象。AMP-S-2-N/S-2的加入都使DNA的正峰和負峰強度都降低了，且S-2-N使負峰降低強度更大，說明二者都使DNA的雙螺旋結構變得松散，也消弱了DNA堿基對之間的π-π堆積作用；圖中DNA的CD譜峰位未發生紅移（即左右平移），說明二者只影響了DNA的二級結構，沒有引起雙螺旋的解旋。該結果暗示了AMP-S-2-N與DNA發生了堿基嵌插或溝槽作用。

2.3.4 抗菌肽對細菌細胞周期及細菌DNA復制與修復相關基因表達的影響 凝膠阻滯試驗和圓二色譜法分析可知，AMP-S-2/S-2-N可以引起DNA結構的變化。DNA是信息傳遞的載體，故DNA的基本功能必定受到影響，因此利用流式細胞術分析了抗菌肽對大腸桿菌細胞周期的影響。

圖11-A為正常大腸桿菌的細胞周期圖，處于S期的細胞數為18.14%，陽性對照組（Buforin II）進入S期的細胞數為33.10%。經S-2/S-2-N處理后，如圖11-B-C所示，處于S期的細胞數為23.86%和26.32%，雖然比陽性對照組（Buforin II）稍低，但與對照組相比有明顯差別（P＜0.05），說明S-2和S-2-N可以使細胞停留于S期，進而抑制細胞的增殖。

圖8 抗菌肽S-2（A）和 S-2-N（B）分別與大腸桿菌DNA作用的凝膠阻滯分析

圖9 抗菌肽S-2（A）和 S-2-N（B）分別與大腸桿菌RNA作用的凝膠阻滯分析

如圖12顯示，陽性對照組為Buforin II（5-21）處理，陰性對照組為PBS處理?；騞naA、dnaB、dnaG和SSB與DNA復制相關。在S-2和S-2-N的作用下，基因dnaA在經S-2-N處理后表達水平明顯降低為56.68%（P＜0.05），比陽性對照組62.03%還低；dnaG在實驗組（S-2-N）中，表達量為66.00%，與陽性對照組64.78%結果類似；其他基因dnaB和SSB的表達量也均有一定程度的降低。RecA和RecN是與DNA修復相關的基因，與陰性對照組相比，S-2組為1.17倍和1.08倍，而S-2-N組是1.24倍和1.3倍（P＜0.05），二者的表達量均有增加，與陽性對照組類似，說明S-2/S-2-N都可以損傷DNA，且暗示了S-2-N引起的DNA損傷高于其親本。表明S-2/S-2-N可以影響DNA復制與修復相關基因的表達。

圖10 抗菌肽S-2和S-2-N分別對大腸桿菌DNA二級結構的影響

3 討論

AMP-S-2是一種分離自少棘蜈蚣毒液的陽離子肽，具有廣譜的抗菌活性，但并不夠理想。本實驗室通過前期對AMP-S-2進行酰胺化改造，獲得了AMP-S-2-N。在此基礎上，本研究首先采用瓊脂糖孔穴法，通過篩選不同菌種，發現AMP-S-2和S-2-N對E.coliK12D31具有較強的抑制作用，且AMPS-2-N比親本具有更強的抑菌活性，最小抑菌濃度（MIC）實驗也印證了這一點。

據報道，分別來自豬和牛的抗菌肽PR-39和Indolicidin都具有無規則卷曲的松散結構，其作用機制是通過抑制大分子合成來發揮抗菌作用［21］。本實驗通過圓二色譜儀預測AMP-S-2和S-2-N的二級結構，發現二者具有無規則卷曲的松散結構；且AMPS-2-N的負峰峰值降低，峰位上移，這可能與其抗菌活性更強的原因之一。

另外，抗菌肽本身也存在著許多亟待解決的問題，如抗菌肽進入人體后易被蛋白酶水解，穩定性低等在新藥開發研制中普遍存在。于是，在本文中AMP-S-2和S-2-N在經熱、不同pH緩沖液、不同離子強度和不同蛋白酶處理后的，二者均100℃熱的耐受性較強，僅在作用半小時后抗菌能力才有所下降；對強酸和強堿的環境具有不敏感性；對不同離子強度也具有一定的耐受力；可抵抗消化酶的消化作用。AMP-S-2和S-2-N的這種對消化酶的不敏感性，有利于開發為口服藥，此研究解除了對抗菌肽易被體內蛋白酶水解及穩定性低方面的擔憂。

圖11 抗菌肽對大腸桿菌細胞周期的影響

圖12 抗菌肽對大腸桿菌復制與修復相關基因表達的影響

有研究認為，抗菌肽在發揮抑菌作用時，首先攻擊的位點是細胞膜，通過促使細胞膜破裂等起到殺死細菌的作用，例如，抗菌肽Alamethicin主要通過由3-11個螺旋桿排列形成跨膜螺旋束或形成桶-板模式使細胞膜上形成許多孔洞，從而增強細胞膜的通透性而殺死細菌［22］。本實驗通過激光共聚焦顯微鏡觀察得知，FITC綠色熒光可以充滿整個細菌細胞，表明S-2/S-2-N能夠完全進入細胞質內，且暗示了S-2/S-2-N的作用靶點應位于細胞質內。

據報道，環形肽可以擾亂磷脂雙分子層形成1-2 nm的環形孔，導致細胞內容物大量外漏發揮殺傷作用［23］。通過電子透射顯微鏡觀察超微結構發現，S-2/S-2-N處理細胞2 h后，大腸桿菌細胞均有內容物流出，且S-2-N可使細胞達到基本破裂，甚至瓦解，最后導致細菌死亡。

有研究發現，抗菌肽protegrin-1（PG-1）以一種依靠脂質成分的膜相互作用方式來穿透細胞膜發揮殺菌作用［24］。于是，我們利用流式細胞儀檢測了S-2/S-2-N對大腸桿菌細胞完整性和穿透效率的影響，結果發現對大腸桿菌菌膜的破壞作用不太強，但二者穿透細胞膜的效率比較高（即陽性細胞的比例），且S-2-N的穿透效率達到了54.97%。此結果正好與透射電鏡所觀察到的結果一致，均說明了AMPS-2-N具有更強的殺菌能力。

大多數抗菌肽的作用靶點為細胞膜，通過破壞或溶解細胞膜來達到殺傷細菌的效果。而研究發現有些抗菌肽的作用靶點則位于細胞內，例如，抗菌肽Indolicidin可以誘導大腸桿菌絲化并抑制大腸桿菌DNA的合成［25］。在本實驗中，AMP-S-2-N和AMP-S-2的主要作用部位就是胞內的核酸-DNA。從圖7可以看出AMP-S-2-N/S-2都減少了大腸桿菌（K12D31）細胞中DNA/RNA的含量，即影響了核酸的合成。已報道，抗菌肽Butorin II穿透大腸桿菌細胞膜后與DNA和RNA結合，抑制細胞功能從而導致細菌快速死亡；而magainin 2也可以進入細胞內與DNA和RNA結合，從起到抑菌作用［26-27］。本文通過凝膠阻滯實驗證明了AMP-S-2-N和AMP-S-2可以不同程度地結合DNA和RNA，呈濃度梯度依賴性，且AMP-S-2-N結合DNA的能力強于母體肽。另外，圖9結果與凝膠阻滯實驗結果相一致，再次證明了AMP-S-2-N和AMP-S-2與DNA具有親和力，但具體抗菌肽通過哪種作用力與DNA什么部位結合需要進一步探究。

此外，有些抗菌肽可以抑制DNA復制相關的酶，如PR-39［28］。本實驗發現，AMP-S-2-N 和AMP-S-2不僅能夠影響大腸桿菌的細胞周期而且對DNA相關基因的表達也有影響。從圖11可以看出，在正常大腸桿菌的細胞周期圖中，處于S期的細胞數為18.14%，S-2/S-2-N處理后，處于S期的細胞數為23.86%和26.32%，與陰性對照組有明顯差異，且與陽性對照組（Buforin II）33.10%結果類似，說明AMP-S-2-N和AMP-S-2抑制了大腸桿菌細胞周期的進行；另外，通過RT-PCR技術分析與大腸桿菌DNA復制和修復相關的基因表達情況發現，AMPS-2-N和AMP-S-2下調了基因dnaA、dnaB、dnaG和SSB的表達，同時促進了RecA和RecN的表達。

綜上所述，AMP-S-2-N和AMP-S-2 通過抑制大腸桿菌DNA和RNA合成，能夠結合DNA和RNA，影響DNA二級結構以及細胞周期和DNA相關基因的表達，從而達到抑菌的效果。

4 總結

本研究主要以少棘蜈蚣抗菌肽 Scolopin-2-NH2為研究對象，對其抗菌活性、理化性質以及在細胞和分子水平上抗菌機制的進行了探究。得出了以下結論：（1）抗菌肽Scolopin-2-NH2及其母體肽對E.coliK12D31具有較強的抗菌活性，且Scolopin-2-NH2強于母體肽；研究發現抗菌肽Scolopin-2-NH2和Scolopin-2具有無規則卷曲的松散二級結構，這可能與其抗菌活性有關；另外，二者對外界環境（熱、酸堿、離子、消化酶）具有一定的穩定性。（2）從細胞水平對抗菌機制研究表明，抗菌肽 Scolopin-2-NH2及其母體肽不僅可以破壞大腸桿菌胞膜、快速地進入細胞質內使細菌內容物泄露，還通過結合DNA/RNA及影響DNA二級結構來達到抑菌效果。（3）從分子水平對抗菌機制研究顯示，抗菌肽Scolopin-2-NH2及其母體肽還可以阻滯大腸桿菌的細胞周期，抑制DNA復制相關基因（dnaA、dnaB、dnaG和SSB）表達和促進DNA修復相關基因（RecA和RecN）的表達來抑制大腸桿菌的細胞增殖，從而發揮抗菌作用。