豬PEDV與PDCOV二重RT-PCR檢測方法的建立

孔維歡 王晶晶 萬鵬程 石國慶

（1. 石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2. 新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，石河子 832000）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬丁型冠狀病毒（PDCOV）均屬于冠狀病毒科，是兩種能夠引起仔豬腹瀉、脫水嚴重致死等癥狀的冠狀病毒。其中PEDV對不同品種和各年齡段的豬都可以發生感染，尤其是出生在10日齡以內的哺乳仔豬最易感染死亡［1-2］。由PEDV感染的腹瀉疾病我們稱為豬流行性腹瀉（PED），是以仔豬消化道病變癥狀為主要特征的急性、高度接觸性傳染病，也是目前嚴重危害中國規模化養豬行業仔豬腹瀉病的主要病原之一［3］。早在1976年我國就首次報道了PEDV的存在，之后在2010年開始我國大面積暴發PEDV，引起仔豬因腹瀉、脫水致死率高達100%，這給我國的養豬業造成了嚴重的經濟損失［4］。

PDCOV是近年來新發現的單股正鏈RNA病毒，一種能夠引起仔豬急性水樣腹瀉的新發δ冠狀病毒［5］，也是危害世界生豬養殖業潛在的因素。在2012年研究者Woo等［6］曾在豬糞便樣品中檢測到了PDCOV，接著美國俄亥俄州從腹瀉仔豬中也首次發現了PDCOV［7］，隨后加拿大和韓國等也相繼報道了PDCOV，且陽性檢出率達25%［8］。在2004-2014年Dong等［9］對我國安微、廣西、湖北、江蘇4個地區病料檢測中也陸續發現了PDCOV，說明PDCOV早在十幾年前就已經在我國豬群中存在。

近年來，畜牧業規模化養殖迅猛發展，由于環境和畜禽個體等因素的相互作用，導致細菌病毒發生變異而難以控制，造成經濟上的巨大損失。例如，引起仔豬腹瀉疾病的PEDV變異毒株目前在全國范圍內普遍傳播，疫苗免疫也很難有效的防控。而且當前許多疾病的臨床癥狀極為相似，病毒的混合感染并發癥非常嚴重、難以診斷。如引起仔豬腹瀉病的PEDV和PDCOV多混合感染，且臨床癥狀、流行病學和病理變化非常相似［10-11］，僅通過臨床觀察、常規診斷方法，很難滿足臨床上快速鑒別診斷的需求，因此建立快速、準確的檢測方法至關重要。基于以上研究背景，本研究以分離的毒株為研究對象，主要采用單一RT-PCR和二重RT-PCR的方法及特異性、敏感性試驗進行優化建立一種能夠快速靈敏地鑒定出一種病毒或雙重病毒混合感染的檢測技術，并將其用于臨床樣品的初步檢測驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬丁型冠狀病毒（PDCOV）細胞分離毒株以及采集的疑似病毒性腹瀉糞便樣品，PRV、CSFV、PPV等病毒均由新疆農墾科學院獸醫實驗室提供保存。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出物（Biowest公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），溴化乙錠（EB）、無水乙醇、氯仿、異丙醇（北京化工廠），反轉錄試劑盒、ddH2O（北京全式金公司），dNTP、Taq 酶、10×Buffer、DNA Marker（TaKaRa公司），質粒提取試劑盒、PMD18-T載體、EcoRⅠ、Hind Ⅲ內切酶（寶生物工程有限公司）。

1.1.3 主要器材 電熱恒溫鼓風干燥箱（XMT-152A）、恒溫水浴鍋（DKS22）、離心機（德國SIGMR公司）、全自動凝膠成像系統（英國Syngene公司）、核酸電泳儀（Bio-Rad公司）、分光光度計（Thermo公司）、PCR儀（Eppendorf公司）、1.5 mL離心管和培養皿等。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取及反轉錄cDNA單鏈的合成 取 200 μL病毒樣品，按照 Trizol（Invitrogen）試劑說明書分別提取各病毒的總RNA。利用紫外分光光度計測定OD260/OD280值和RNA濃度，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。確保所提總RNA的OD值在1.8-2.0之間，無蛋白和基因組污染。按照 TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，并結合實際進行適當調整。

1.2.2 引物的設計及合成 根據GenBank已收錄發表的PEDV和PDCOV基因序列，應用Primer Premier 5.0進行引物設計，引物跨內含子并處在基因的高保守區域。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 單一RT-PCR擴增 以陽性對照疫苗株RNA轉錄獲得的cDNA為模板，分別以表1中兩對引物進行單對引物擴增。采用25 μL反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL， 上 下 游 引 物 F/R 各0.5 μL，Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 19.1 μL，cDNA 模板1 μL。94℃預變性4 min后，進入94℃變性30 s，PEDV 55℃、PDCOV 56℃退火 30 s，72℃ 45 s的循環，共循環35次；最后72℃延伸10 min，12℃保存。取PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。將電泳分析正確的目的片段，連接pMD-18T載體，轉入大腸埃希菌DH5α，進行PCR克隆與測序，DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成，所獲序列經鑒定正確。

表1 二重RT-PCR引物設計結果

1.2.4 二重RT-PCR的建立 在單對引物擴增成功的基礎上，將目的基因PEDV-M、PDCOV-N加入同一PCR反應體系中配制二重RT-PCR反應混合液。將兩對引物同時加入擴增體系，經反復試驗優化最佳 PCR 反應體系（25 μL）：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，兩對上下游引物F/R各0.5 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 17.1 μL，cDNA 模板各 1 μL。建立二重RT-PCR擴增優化體系，反應程序為：94℃預變性4 min后，進入94℃變性30 s，PEDV、PDCOV均56℃退火30 s，72℃ 45 s的循環，共35次循環；最后72℃延伸10 min，12℃保存。取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，將鑒定正確的PCR擴增產物轉入大腸埃希菌DH5α載體，篩選陽性重組質粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.5 特異性實驗 按照1.2.1，1.2.3優化的二重RT-PCR體系條件分別對實驗室保存的PRV、CSFV、PPV的核酸進行提取反轉錄擴增，并以PEDVPDCOV混合模板擴增為陽性對照。然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，檢驗該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗 將PEDV和PDCOV細胞毒株混合物為陽性對照。用紫外分光光度計檢測核酸濃度，將cDNA按10倍以內的濃度梯度稀釋，調整核酸濃度，分別以它們為模板，按照已優化的二重RT-PCR反應體系進行PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，檢測其敏感性。

1.2.7 臨床應用 取實驗室保存的疑似病毒性腹瀉糞便樣品12份，按照上述方法建立的二重RT-PCR技術，檢測是否被PEDV和PDCOV感染。

2 結果

2.1 單對引物特異性RT-PCR擴增

對PEDV病料RNA進行提取反轉錄，通過RTPCR方法對PEDV-M基因片段進行擴增和測序，獲得一條大小為750 bp的特異性目的條帶（圖1），并進行了測序鑒定。

圖1 PEDV凝膠電泳圖

然后對PDCOV病料RNA進行提取反轉錄，通過RT-PCR方法對目的基因片段PDCOV-N進行擴增和測序，獲得一條長度為372 bp的特異性目的條帶（圖2）。經測序鑒定是所設計的目的片段。從圖中第1泳道可以看出，在56℃退火溫度下也能擴增出750 bp大小的PEDV-M目的基因。由此，初步確定二重PCR的擴增溫度為56℃。

圖2 PDCOV凝膠電泳圖

2.2 PEDV-PDCOV二重RT-PCR檢測體系的建立與優化

在上述研究基礎上，以PEDV-M和PDCOV-N凝膠回收產物為模板，按照1.2.4設計的多重PCR優化條件進行擴增，凝膠電泳進行檢測分析。結果（圖3）顯示，在第2泳道同時擴增出PEDV和PDCOV的雙重條帶，且目的條帶大小分別與預期目的基因片段大小一致，說明優化的最佳退火溫度為56℃。

圖3 二重RT-PCR的擴增結果

2.3 特異性實驗結果

按照所建立的二重RT-PCR體系對PRV、CSFV、PPV和PEDV-PDCOV混合模板分別進行擴增，結果（圖4）顯示，PRV、CSFV、PPV等病毒基因均為陰性，而PEDV-PDCOV混合模板擴增出了相應病毒的目的片段，即說明了該二重RT-PCR體系的特異性強。

圖4 特異性試驗結果

2.4 敏感性實驗結果

根據5 μL的PEDV和PDCOV的PCR回收產物和標準Marker的5 μL的亮度比較，初步檢測確定回收產物的基因濃度為200 ng/μL和250 ng/μL，然后將核酸濃度分別稀釋。兩核酸混合使其濃度稀釋為200 ng，100 ng，50 ng，25 ng，10 ng，5 ng，1 ng，0.5 ng，0.1 ng的總量，以此作為模板進行擴增。結果（圖5）表明，核酸量為200 ng，100 ng，50 ng，25 ng，10 ng，5 ng，1 ng，0.5 ng均能擴增出相應大小片段，但亮度依次減弱的特異性條帶。而0.1 ng濃度核酸并沒有明顯的條帶出現。因此該PCR體系能夠擴增的核酸濃度下限為100 pg/μL。

圖5 敏感性試驗結果

2.5 二重RT-PCR檢測方法的臨床應用

以建立的二重RT-PCR方法對采集的12份疑似臨床病例樣品進行檢測。結果（圖6）顯示，12份疑似病例樣品中有1份混合病毒感染，1份PEDV感染，2份PDCOV感染，其余8份呈陰性無病毒感染。

圖6 二重RT-PCR臨床檢測結果

3 討論

近年來，隨著國內集約化規模化養豬行業突飛猛進的發展，豬病毒性疾病的發生和流行日益嚴重，發病率、死亡率也越來越高，且多種病毒的變異或混合感染已成當前疫病流行病學的主要形式和特點［12］。它們的臨床癥狀有許多極為相似之處，這給獸醫學者和專家們臨床診斷確定疾病感染帶來了很大的困難，也給養豬業造成了巨大的經濟損失。

本實驗針對由病毒感染引起仔豬腹瀉脫水等臨床癥狀極為相似的PEDV和PDCOV進行單項RTPCR的基礎條件上，參考王隆柏等［13］建立的5種豬病多重PCR檢測方法，通過對病毒引物、dNTP、模板用量及反應溫度等條件的優化，建立了靈敏度好特異性強的PEDV-PDCOV二重RT-PCR快速鑒別診斷的方法。多重PCR在同一體系實現對多個目的基因的特異性擴增并不是單項PCR簡單的混合，例如我們實驗所建立的二重RT-PCR反應體系，引物設計就是其中一個最關鍵的因素。它除了決定著反應程序中的退火溫度及引物二聚體的形成與否外，還影響著反應的特異性和擴增效率等。

相對于耗時費力、敏感性和特異性不高的病毒分離、免疫熒光和酶聯免疫吸附實驗等傳統的豬群疫病檢測方法，聚合酶鏈式反應（PCR）更能被廣泛應用于各種病毒檢測［14］，但常規的應用多重PCR檢測多種病毒也費時費力。所以，本研究通過單項RT-PCR技術條件的優化擴增出了PEDV和PDCOV相應的目的片段750 bp、372 bp。初步表明該二重RT-PCR體系的最佳退火溫度為56℃，并通過建立二重RT-PCR優化體系得以驗證。采用該體系對PRV、CFSV、PPV進行特異性實驗，以及PEDVPDCOV進行濃度梯度敏感性擴增，發現該二重RTPCR體系特異性強、敏感性高的特點。通過臨床疑似病例的檢測也說明了方法的高效性。

4 結論

通過實驗研究成功建立了PEDV和PDCOV的二重RT-PCR檢測方法，該方法靈敏度高、特異性好，高效快捷的特點，在臨床上能夠快速鑒別診斷出PEDV和PDCOV單獨或混合感染的病例。