植物亞硝基谷胱甘肽還原酶在脅迫反應中的作用研究

夏金嬋

（河南中醫藥大學基礎醫學院，鄭州 450046）

一氧化氮（Nitric oxide，NO）參與植物的許多脅迫反應過程，是一個重要的信號分子，NO可通過翻譯后修飾改變蛋白或酶的活性及功能，主要的調控形式是NO與半胱氨酸上的硫基發生可逆的S-亞硝基化作用，NO還可對金屬蛋白的金屬中心進行亞硝基化，或者與蛋白的酪氨酸殘基結合發生不可逆的硝化作用。NO屬于活性氮分子（Reactive nitrogen species，RNS），其半衰期很短，這限制了它在細胞中的生理功能。胞內含硫基的分子能夠與NO相互作用，形成S-亞硝基硫醇（S-nitrosothiols，SNO），其也屬于RNS，但是比NO的化學性質穩定，在植物的生長發育及抗逆過程中SNOs參與NO的運輸、擴散、儲存以及蛋白的翻譯后修飾過程［1］。NO及RNS能夠與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在有氧條件下發生S-亞硝基化作用形成S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO），GSNO是一個穩定的NO儲存庫和轉運形式［2］。

乙醇脫氫酶Ⅲ（Alcohol dehydrogenase Ⅲ，ADH3）普遍存在于真核與原核生物，而且高度保守，參與甲醛的解毒過程（甲醛+谷胱甘肽+NAD+S-甲酰谷胱甘肽+NADH+H+），而且該酶還催化依賴NADH的S-亞硝基谷胱甘肽還原成氧化型的谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）和NH3的過程［3］，該過程也可被看作是一個亞硝基化作用，影響GSNO的水平，進而影響細胞內NO的含量。在植物和其他生物中亞硝基谷胱甘肽還原酶（S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR）最初被認定為是一個依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶，后來發現催化反應過程包含S-亞硝基谷胱甘肽羥基的氧化，以及谷胱甘肽與甲醛形成S-甲?；入赘孰摹Ｒ虼?，重新命名為S-亞硝基谷胱甘肽還原酶，該酶參與S-亞硝基硫醇的代謝過程。GSNOR在進化過程中相當保守，在保護細胞免受硝化脅迫中起作用，GSNOR屬于乙醇脫氫酶Ⅲ家族，同源二聚體，每個亞單位含有兩個鋅原子，NH3和GSSG是GSNOR催化的產物［4］，GSNOR以把NO轉移到特定的蛋白上，使蛋白發生亞硝基化，調控GSNO與蛋白亞硝基化之間的平衡，穩定胞內NO的含量，而且該過程影響胞內GSH與NADH的含量，間接的調控細胞的氧化狀態［5］。本文主要就植物中GSNOR的結構特點、表達部位以及參與植物生長發育、生物與非生物脅迫等過程進行了概述，探討其在植物生長發育及脅迫反應中的作用機制，旨為以后對GSNOR功能的深入研究奠定基礎。

1 植物中的GSNOR

在高等植物中首先在擬南芥中檢測到了GSNOR的活性，把擬南芥中一個推測的依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶的cDNA（AT5G43940）在酵母中表達，能夠恢復GSNO代謝缺陷的酵母對GSNO敏感的表型［6］，過表達或敲除GSNOR基因的植株都表現出短根的表型［7］。還有研究表明GSNOR通過蛋白的亞硝基化參與細胞死亡過程［8］。擬南芥GSNOR cDNA編碼一個由379個氨基酸（42.5 kD）組成的蛋白，該蛋白高度保守，與番茄中GSNOR的序列相似度達90%。半胱氨酸殘基（Cys）是氧化脅迫的重要修飾位點，參與氧化信號的傳導過程。植物的GSNOR含有14-16個Cys，其中的13個在植物中保守，Cys10、Cys271和Cys370位于蛋白的表面為進行翻譯后修飾提供條件。

圖1 GSNOR調節植物細胞亞硝基化水平圖解

植物GSNOR缺失突變體中S-亞硝基硫醇（S-nitrosothiols，SNO）的含量升高，包括大分子量與小分子量的SNO，這暗示GSNOR的活性不僅調控植物中GSNO的含量，而且間接影響蛋白的亞硝基化水平，GSNOR缺失影響植物的正常生長發育，抗病性降低，對高溫敏感，對脅迫誘導的細胞死亡不敏感［9-10］（圖1）。目前，有許多GSNOR的相關突變體，擬南芥中有GSNOR缺失突變體（hot5-2/gsnor1-3）、過表達突變體和啟動子區的插入缺失突變體（GSNOR的表達量卻上調），番茄中也有GSNOR的缺失或過表達突變體，這些為研究GSNOR的功能提供了條件。在過去20年中，GSNOR的功能被在多個物種中進行了研究，如擬南芥、辣椒、番茄、向日葵、煙草、豌豆、花椰菜和萵苣等。

2 GSNOR的亞細胞定位

在擬南芥中利用GSNOR-GFP融合蛋白的方法分析了GSNOR的亞細胞定位，發現GSNOR在根、葉、種子和花（花藥、花絲、子房、柱頭、花瓣和花粉）中都有表達，特別是根尖和莖尖分生組織［11］。亞細胞定位研究證明GSNOR定位在細胞質，但也有研究表明其定位在過氧化物酶體，還需要進一步探討［12］。利用GSNOR的抗體發現在葉片橫切面上的微管組織及表皮細胞中也有表達［13］。在向日葵中發現GSNOR在下胚軸的皮層細胞與微管組織中表達［14］。在豌豆的葉片細胞中GSNOR亞細胞定位在葉綠體、胞質、線粒體與過氧化物酶體，GSNOR的亞細胞定位與ROS和NO在細胞中的定位（過氧化物酶體、線粒體、葉綠體）重合，為細胞氧化狀態對GSNOR進行調節提供了可能性［15］。

3 GSNOR參與植物對生物脅迫的反應過程

GSNOR參與植物正常的生長發育過程，在擬南芥中除了成熟的花粉外其他組織中都有表達，但是在根和葉片中的表達量比較高［7］。在擬南芥中GSNOR參與胞內SNO的形成，調控SNO的含量，參與植物的抗病反應過程［16］。擬南芥中GSNOR缺失突變體的基因芯片結果表明，在170個下調的基因中1/3的基因是參與真菌感染脅迫反應過程的［11］。在擬南芥中通過反義RNA干擾獲得的GSNOR低表達的轉基因植株表現出對寄生霜霉（Peronospora parasitica）感染的抗性，可能與胞內高含量的SNOs及抗病基因PR-1的高表達相關，GSNOR過表達植株中系統獲得性抗病能力下降，而且韌皮部有GSNOR的表達，有利于系統獲得性抗病信號通過韌皮部的傳導［17］。當霍爾斯單軸霉（Plasmopara halstedii）感染向日葵下胚軸時，GSNOR的活性與GSNO的分布與含量負相關，GSNO原本在皮層中積累，當感染霍爾斯單軸霉時GSNO則在表皮中積累，此處正是向日葵感染的部位，因此在感染前后從GSNO的分布位置改變來看GSNO可能與向日葵的抗性有關［18］。GSNOR參與了萵苣對生物營養霉菌的脅迫反應過程，霉菌的感染能夠提高萵苣GSNOR基因及蛋白的表達量［19］。

4 GSNOR參與植物對非生物脅迫的反應過程

人們分析了不同脅迫條件下GSNOR的活性與表達情況，當豌豆生長在50 μmol/L鎘的脅迫下，GSNOR的活性與轉錄水平下降了31%，并伴隨著NO、GSH及GSNO含量的減少［20］。在鎘的脅迫下三葉草中的GSNOR活性提高［21］。但是，在擬南芥中的研究結果卻相反，0.5 mmol/L的砷能抑制根的生長，并能造成氧化脅迫，當擬南芥在0.5 mmol/L砷脅迫下，GSNOR的活性的活性顯著增加，并伴隨著NO的含量增加［22］。

在擬南芥中篩選得到一個對高溫敏感的突變體hot5-2，突變位點在GSNOR基因，暗示該酶可能與植物對溫度的抗性有關，然而，當野生型的擬南芥遭受高溫脅迫條件時，GSNOR蛋白的表達量并沒有發生變化，也不影響Hsp101、sHspI 和sHspII等熱休克相關蛋白質的表達量，這說明在擬南芥中GSNOR對耐熱性的影響不是通過熱休克蛋白通路來作用的。研究發現，突變hot5-2突變體中亞硝基化水平幾乎是野生型的2倍，細胞中的亞硝基化成分可導致亞硝基化脅迫，增加細胞中NO的含量。利用4-氨基-5-甲氨基-2'，7'-（4-amino-5-methylamino-2'，7'-di fl uorescein diacetate）（DAF-FM DA）對擬南芥的原生質體進行染色發現，熱處理能夠引起野生型擬南芥中NO含量的輕微增加，而突變體中NO的含量本來就高，熱處理前后變化不明顯，外源NO的供體SNP能夠引起葉片黃化及死亡，突變hot5-2更嚴重，NO 清除劑cPTIO能提高擬南芥對熱的耐受性，內源NO含量升高的突變體nox1也表現出熱敏感植物表型，因此，GSNOR可能夠通過調控內源NO水平，從而影響植物熱敏感性［23］。向日葵幼苗在38℃下處理4 h，下胚軸中GSNOR的活性、蛋白及基因表達量都下調，同時SNOs的含量升高，推測GSNOR調節胞內SNOs的含量，SNOs能夠釋放NO，參與蛋白的硝基化過程［24］，然而，將豌豆幼苗進行相同處理，GSNOR的活性與SNOs的含量都是增加的［25］。將辣椒植株放在8℃下處理24 h，GSNO還原酶的活性增高32%，NO的含量降低50%，伴隨著GSH含量的升高［26］。煙草葉片在機械損傷2 h后GSNOR基因與蛋白的表達水平下調［27］。

高鹽脅迫影響植物的生長、限制作物的產量，在擬南芥中鈣調素4（CaM4）參與植物的非生物脅迫反應過程，其缺失突變體表現出對高鹽脅迫敏感的表型。另外，NO也參與植物的高鹽脅迫反應過程，GSNOR作為植物體內NO穩態的重要調控基因，研究表明CaM4通過與GSNOR結合，減低其活性，從而促進NO的積累，調控植物的反應過程［28］。向日葵幼苗根系對鹽脅迫的敏感性較高，在鹽脅迫下GSNOR活性顯著降低。將向日葵幼苗放在120 mmol/L NaCl處理下，二硫代赤蘚醇能夠恢復GSNOR活性，表明該酶的活性改變是可逆的。鹽脅迫增強了子葉中蛋白質的亞硝基化，而根則表現為蛋白質的脫氮化。61種發生亞硝基化的蛋白中，17種是子葉特有的，4種是根特有的，而40種是兩者共同的。這些觀察結果表明，向日葵幼苗在鹽脅迫下，在NO的信號傳遞過程中通過S-亞硝基化和去硝基化作用調節各種酶活性［29］。

在碳酸氫鈉處理0.5-2 d，番茄中GSNOR的表達受到明顯的抑制，3 d后表達量開始上調，6 d達到最大，之后開始下調。過表達GSNOR基因的植株表現出對堿性鈉鹽脅迫的抗性，這與抗氧化基因APX、CAT、DHAR、GR的高表達有關；反義抑制GSNOR活性的植株則有敏感的表型，盡管SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、H-ATPase、HKT1和HKT2基因表達量上調。但是，RNS和ROS的積累造成了非常嚴重的氧化脅迫，誘導細胞死亡［10］。

百草枯（1，1-二甲基-4，4'-聯吡啶鎓鹽二氯化物）是一種非選擇性除草劑，能誘導植物中超氧化物與過氧化氫的產生。Chen等在擬南芥中通過篩選得到了一株對百草枯不敏感的突變株par2-1，圖位克隆發現突變位點在GSNOR基因中224位氨基酸殘基由甘氨酸變成了天冬氨酸，即HOT5基因，缺失突變體gsnor1/hot5/par2中NO的含量升高，過表達GSNOR/HOT5/PAR2基因能夠植株中NO的含量，NO供體SNP處理能提高植物對百草枯的抗性，即突變體par2-1中高含量的NO能緩解百草枯引起的細胞死亡，從而提高擬南芥對百草枯的抗性，這些結果表明GSNOR調控胞內NO的穩態［7］。在擬南芥中GSNOR還參與對損傷和水楊酸的脅迫反應過程［27］。但是，向日葵下胚軸受到機械損傷時GSNOR的活性下調，伴隨著SNO含量的增加［14］。煙草葉片在受到機械損傷2 h后，GSNOR的mRNA和蛋白的表達水平都下調［27］。

植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）參與植物的抗逆反應過程，在保衛細胞中ABA能夠誘導NO的產生，研究表明NO通過亞硝酸化open stomata 1（OST1）/SnRK2.6（Sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2.6）蛋白第137位的半胱氨酸，抑制氣孔開放，負調節保衛細胞中ABA的信號傳遞過程，GSNOR基因缺失突變體gsnor1-3植株保衛細胞中NO含量增加，由于SnRK2.6蛋白的亞硝基化，導致ABA不能誘導氣孔關閉［30］。

5 GSNOR對細胞氧化水平的調節

生物與非生物脅迫都能造成植物體內ROS或者活性氮NO/SNO的積累，破壞細胞內的氧化平衡，通過氧化作用調控含硫蛋白的活性，實現信號的傳導。一方面，GSNO能夠儲存和轉運NO，對蛋白質（酶、受體、轉錄因子、離子通道等）進行轉錄后修飾，形成蛋白-Cys-SNO，即調控細胞內SNO的水平，對NO的信號傳遞過程進行微調；另一方面，GSNOR能夠調控胞內GSNO/SNO的含量調控細胞的氧化狀態。另外，H2O2和除草劑也能夠抑制GSNOR的活性［31］，即氧化脅迫能對GSNOR進行翻譯后修飾，ROS對GSNOR活性的抑制可能是抵抗氧化脅迫的保護機制，這些表明GSNOR可能ROS與RNS的信號轉導的交匯點。SNP（Sodium nitroprusside，NO）的供體和除草劑共同處理能夠也提高野生型擬南芥對除草劑的抗性，可能是NO/SNO通過抑制GSNOR的活性抵抗氧化脅迫的一種機制，在馬鈴薯與水稻的研究中也得到了相同的結果［32］。NO與ROS的相互作用還表現在gsnor突變體在除草劑的處理下體內H2O2的含量下降，可能是NO直接清除ROS形成過氧亞硝基（ONOO-）的結果［32］。另外，ONOO-還可以通過抑制SOD降低H2O2的產生［33］。三葉草在鎘的脅迫下，GSNOR活性提高，伴隨著NO和GSNO含量的下降，改變植物體的氧化還原狀態［21］，誘導ROS、NO、過氧亞硝酸鹽（ONOO-）和NADPH氧化酶、過氧化物酶和GSNOR的活性顯著增加［34］。另外，在免疫反應過程中NO/SNO通過亞硝化抑制NADPH氧化酶的活性，降低ROS的產生［35］。最近的研究發現在擬南芥中抗壞血酸過氧化物酶1（APX1）的亞硝基化能增強其清除H2O2的能力，抵抗氧化脅迫［36］。豌豆在鹽脅迫條件下亞硝基化也能增強APX1的活性［37］。

6 展望

S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）是一個天然的NO儲存庫，因此研究GSNOR在植物生長發育及脅迫反應中的作用機制，將有助于我們對NO生理功能的了解。最近的研究還證明GSNOR參與木質部微管細胞的分化過程［38-39］，這表明我們對植物中GSNOR功能還知之甚少。在植物中GSNOR 基因的功能研究多局限于模式植物擬南芥中，且在多種脅迫條件下GSNOR的mRNA 和蛋白質表達水平相對穩定，因此蛋白質翻譯后修飾水平是可能其酶活性調控的主要形式，進一步深入研究GSNOR影響的下游靶蛋白及靶蛋白亞硝基化修飾后功能的變化將是未來的一個研究方向。盡管大量的研究證明非生物脅迫調控GSNOR的表達，但還沒有直接的證據證明活性氧（ROS）直接影響GSNOR的表達，更有可能是一個翻譯后的修飾過程。GSNOR可能是ROS與RNS的信號轉導的交匯點，盡管GSNOR參與調控細胞的氧化狀態，但是細胞內各個部分的氧化狀態不是完全一致的，因此，細胞器的氧化狀態與GSNOR的關系將是未來的研究重點。