利用CRISPR/Cas9技術定點敲除煙草多酚氧化酶基因NtPPO1

姚恒 楊大海 白戈 謝賀

（云南省煙草農業科學研究院，昆明 650021）

在植物中，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）能將酚類物質催化反應出能直接殺滅病原菌的醌類物質，被認為對植物抗蟲、病菌等生物因素性脅迫是有益的。然而，因為PPO催化產生深褐色的醌類物質又直接危害果蔬、水稻及小麥等農產品的外觀品質，因此，過強的PPO酶活性對作物的品質有害。植物中的PPO的功能具有多樣性，在豆類［1］、番茄［2-3］、馬鈴薯［4］、紅三葉草［5-6］、蘋果［7］、水稻［8］和小麥［9-10］等植物中已有大量的報道。育種學家在研究PPO基因功能的基礎上，根據需求選育出PPO酶活性強或者弱的品種，創制出抗病蟲害或者不易褐化的產品。煙草也存在抗病蟲害與低褐變煙葉品種的需求，利用現代分子標記手段揭示煙草品種耐烤性的分子基礎，提出決定煙草品種耐烤性的候選基因［11-12］。但煙草PPO基因的功能研究主要集中在煙草調制過程中褐變與PPO酶活力相關性的研究［13-16］。針對煙草PPO基因功能的研究相對較少［17-23］。研究煙草PPO基因功能，需要創制突變體材料。CRISPR/Cas9技術于2015年成功應用于煙草［24］基因功能研究，目前，國內關于煙草中CRISPR/Cas9技術的應用正在普及。為了獲得NtPPO1的定點突變體，本研究利用CRISPR/Cas9技術構建煙草多酚氧化酶NtPPO1的編輯載體，篩選NtPPO1被定點編輯敲除的純合突變體。通過實時定量PCR技術檢測到突變體中NtPPO1的相對表達量，突變體的創制為研究其基因功能奠定了材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

栽 培 煙 草 品 種（Nicotiana tabacum）K326、DH5α大腸桿菌與LBA4404農桿菌感受態為云南省煙草農業科學研究院實驗室保存。pORE-CRISPR/Cas9植物表達載體由西南大學惠贈。引物合成和測序均由上海英濰捷基貿易有限公司（Invitrogen）完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和基因克隆 以煙草葉片cDNA為模板，根據NtPPO1序列設計引物（F：5'-ATGGC TTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3'；R ：5'-TTAACAA GGGACCAACTGGATCTCAAC-3'），利用 Q5 超保真DNA聚合酶進行擴增，擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。回收、純化、連接和轉化，經抗性篩選，PCR鑒定后挑選陽性單克隆菌落測序驗證。

1.2.2 sgRNA表達載體的構建 根據測序正確的NtPPO1序列，設計靶位點sgRNA序列：5'-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-TGG-3'作 為CRISPR/Cas9敲除NtPPO1的靶位點序列。

根據pORE-CRISPR/Cas9植物表達載體構建方法，需要在sgRNA靶序列添加核苷酸G與BsaⅠ的酶切接頭（F：5'-GATTGCATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3'；R ：5'-AAACTGGAGCTTGAAGAACAAAT GC-3'）。sgRNA退火反應：在PCR儀器中設定程序每8 s降低0.1℃，將混合單鏈引物從95℃降至4℃以形成引物DNA雙鏈。

利用BsaⅠ酶切pORE-CRISPR/Cas9植物表達載體，將其與已退火好的靶位點DNA引物進行連接，構建成NtPPO1的CRISPR/Cas9載體。將目的載體直接轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用含卡那霉素的抗性培養基篩選陽性克隆。利用上游引物：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'， 與 sgRNA 反向引物配合PCR篩選陽性菌落。

1.2.3 農桿菌轉化載體構建與煙草遺傳轉化 提取克隆載體中的質粒轉化農桿菌LBA4404。利用含載體農桿菌浸染煙草葉盤8-10 min。然后經過2 d共培養，轉移至含有NAA、6-BA和卡那霉素（50mg/L）以及頭孢噻肟鈉（500 mg/L）的MS固體培養基中進行組培再生，獲得轉基因煙草植株。

1.2.4 煙草NtPPO1突變體的篩選 提取轉基因煙草植株DNA。利用Kana引物（F：5'-CAGGTTCTCC G G C C G C T T G G-3'，R ：5'-GGAGATCCTGCCCCGG-CACT-3'） 進 行PCR，檢測陽性植株。利用Cas9引物（F：5'-TGTCGGGACAGGGCGACAGT-3'，R：5'-CGCCGCGTTCAGCCTTTGTG-3'）進行 PCR，檢測陽性植株。

挑取經PCR檢測陽性的煙草小苗，設計包含靶位點區域的長度為770 bp的片段引物（F：5'-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3'，R：5'-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3'）進行檢測。

PCR擴增NtPPO1片段，擴增產物經測序、比對后，分析轉基因后代植株中NtPPO1在靶位點處核苷酸序列變化。

基因編輯成功的轉基因陽性T1植株，分單株套袋自交收獲T2種子。播種萌發T2種子獲得T2小苗100株，提取T2植株DNA，利用上述方法檢測NtPPO1突變情況，并分析T2純合突變煙草中NtPPO1序列在靶位點處突變類型。

1.2.5 煙草NtPPO1的Real time-PCR檢測 按照Quant qRT-PCR kit（SYBR Green）（TIANGEN 公司）使用說明在QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR儀器（ABI公司）上進行qRT-PCR檢測。3個生物學重復，3個技術重復，利用Excel進行統計分析，以sigmplot軟件繪制qRT-PCR分析圖。分析NtPPO1的相對表達量，內參基因為26S。所需引物為NtPPO1_qRT_F：5'-AGCACTGCCTTTATTGATGATGG-3'，NtPPO1_qRT_R：5'-ACTTAGCTATGTATTCGTCATCTACAGTT-3'。26S_F：5'-GAAGAAGGTC C C A A G G G T T C-3'，2 6 S_R ：5'-TCTCCCTTTAACAC-CAACGG-3'。

2 結果

2.1 NtPPO1全長cDNA序列驗證

如圖1所示，利用設計的克隆引物以煙草cDNA為模板，特異性擴增出一條約1.8 kb的片段，經測序比對分析NtPPO1的基因座（圖2-A），NtPPO1編碼序列為1 746 bp，其外顯子有3個，其中第2外顯子可以選擇性拼接。測序發現5個克隆中有4個克隆的NtPPO1編碼序列為1、2、3外顯子拼接而成（圖2-B），另外1個克隆的NtPPO1編碼序列為1、3外顯子拼接而成（圖2-C）。NtPPO1可變剪切形式為外顯子跳過，在不改變起始位點的情況下，NtPPO1轉錄后的mRNA會提前出現終止密碼子。跳過的第2外顯子序列為5'-GTACTTATA CTTCCATGAGAGAATCTTGGCTTCCCTAATTGG TGACCCTACATTTGCTTTGCCATATTGGAATTGG GACCATCCTAAAGGCATGCATTTGCCTGACATG TTTGATGTCGAAG-3'。

在野生型的煙草植株中，NtPPO1就存在2種不同的轉錄形式，雖然轉錄本會提前出現終止子（圖2-C），但是煙草中保存這種轉錄剪切方式應該有其重要的生理功能，推測這種無義介導的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNAdecay，NMD）可以監控細胞中的mRNA水平以便煙草能夠快速的響應外界刺激。

圖1 NtPPO1的cDNA擴增產物

圖2 NtPPO1基因座圖

2.2 NtPPO1突變靶位點的選擇與載體構建

NtPPO1的CDS序列經過測序驗證后，選取翻譯起始密碼子ATG后第11-30的20 bp核苷酸序列作為敲除基因的靶位點序列，構建CRISPR/Cas9植物表達載體，目標載體轉入農桿菌后，圖3顯示，通過測序驗證篩選出含sgRNA序列正確插入到CRISPR/Cas9表達載體的農桿菌菌株。

含正確插入sgRNA的基因編輯載體，利用農桿菌葉盤法轉化煙草，經過組培再生成轉基因T1代植株。

圖3 pORE-CRISPR/Cas9∷sgRNA基因編輯載體

2.3 NtPPO1敲除陽性T1植株篩選

通過測序方法篩選NtPPO1被編輯的轉基因植株T1（圖4），編輯成功的T1植株在sgRNA-PAM位點后序列經測序出現雙峰，并且測序峰圖紊亂的情況明顯不一致，說明Cas9蛋白在切斷目標序列后，DNA修復的情況有差異。將此三類轉基因T1雜合突變植株盆栽后自交收種。經過自交分離后產生的T2代植株中，會得到三類NtPPO1純合突變的T2植株。

圖4 NtPPO1定點敲除轉基因T1植株篩選

2.4 NtPPO1突變體的檢測

經測序分析T2植株NtPPO1在目標敲除序列后（圖5），突變體M1植株的NtPPO1缺失了1個G堿基，M2植株的NtPPO1缺失了2個G堿基，M3植株的NtPPO1突變是插入了1個A堿基，此3類突變都會造成NtPPO1編碼序列的移碼突變，如果轉錄出mRNA，在起始閱讀框不變的情況下會提前出現終止密碼子。

圖5 T2代轉基因植株NtPPO1的突變類型

圖6 T2轉基因植株中NtPPO1的相對表達量分析

2.5 突變體內NtPPO1相對表達量的檢測

測定NtPPO1純合突變植株M1、M2、M3的基因表達量如圖6所示，相對于野生型對照，M1、M2、M3突變體NtPPO1的表達量分別下降了75%、84%和76%。結果表明，利用CRISPR/Cas9技術創制的NtPPO1的突變體也影響了此基因的轉錄。在DNA水平上的點突變，造成了基因轉錄水平的改變。NtPPO1的突變是位于第1外顯子區域，而不是位于啟動子區域。理論上，造成NtPPO1表達量降低就應該發生在轉錄后的水平調控，具體是發生在轉錄后的哪個時期還有待進一步的研究。

圖7 NtPPO1純合突變體植株表型

2.6 轉基因煙株表型

如圖7所示，利用CRISPR/Cas9技術創制的NtPPO1突變體與對照野生型煙草之間的田間外觀表型無明顯差異。

3 討論

本研究選取了一個煙草多酚氧化酶NtPPO1進行基因序列克隆驗證，結果表明，NtPPO1存在一種可變剪切形式。在驗證了NtPPO1序列的基礎上，采用CRISPR/Cas9技術，創制1、2 bp堿基缺失和1 bp堿基插入的NtPPO1定點純合突變體M1、M2和M3。通過基因表達發現，突變體中NtPPO1表達水平有顯著的下降。

植物中的PPO功能具有多樣性。根據前人的研究結果，PPO與植物抗蟲、抗細菌性病害的能力相關。但是，在一些作物中通過降低作物中的PPO酶活，會減輕農作物發生褐變的程度，如在葡萄［25］、小麥［26］、水稻［27］等作物中的結果顯示，低的PPO活力能不同程度的顯示出不易褐變、耐貯藏的特性。根據本實驗基因測序的結果顯示，NtPPO1已經被成功敲除，并且基因的表達量也發生了顯著的下降。王曼玲等［28］報道植物的PPO一般存在多個基因編碼，而本研究普通栽培煙草中的PPO基因至少有15個（研究未發表），單獨敲除某一個PPO基因，可能會由于另外一個PPO基因在功能上互補，造成植株整體上的PPO活力下降并不顯著。所以需要研究煙草中的PPO基因的功能，還需要進一步的創制出各PPO基因的突變體，甚至是煙草PPO雙、三基因突變體，才能更全面的研究PPO基因功能。

根據qPCR測定結果顯示CRISPR/Cas9創制的NtPPO1的純合突變體其NtPPO1的表達水平顯著降低。說明利用CRISPR/Cas9在煙草中創制某個基因的定點突變時，也可能會影響此基因轉錄。這個結果和Cai等［29］在大豆中的研究結果類似，Cai等在大豆中靶向敲除控制開花的基因GmFT2a，在長日照和短日照的條件下，GmFT2a的相對表達量下降。根據Wu等［30］的研究表明，真核生物中，如果基因序列存在早期終止子（Premature termination codons，PTCs），相對于沒有PTCs的mRNA，攜帶PTCs的mRNA會通過無義mRNA降解途徑（Nonsensemediated mRNA decay pathway）快速降解，防止因翻譯出無意蛋白的積累才啟動降解蛋白調控。本研究利用CRISPR/Cas9在NtPPO1靠近起始密碼子的核苷酸序列上引入了移碼突變，結果提前出現了終止密碼子，可能啟動了煙草本身的NMD調控途徑，進而造成了NtPPO1的轉錄下降。當然，這只是一個推論。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創制NtPPO1突變體，其NtPPO1表達水平發生下降的機理還有待于進一步的研究。

本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術獲得了煙草PPO基因NtPPO1的編輯敲除突變體，對NtPPO1的功能進行了初步研究，為煙草PPO基因功能研究和煙草育種奠定了材料基礎。

4 結論

本研究克隆驗證了煙草多酚氧化酶NtPPO1編碼序列，并利用CRISPR/Cas9技術成功創制了3個NtPPO1定點突變體材料，NtPPO1在突變體中的表達量顯著降低，而突變材料與對照煙草表型上無顯著差異。