基于SRAP和SSR標記構建的杏扁遺傳連鎖圖譜

王曉燚 孔德晶 艾鵬飛

（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018）

杏扁（Armeniaca vulgaris×A. sibirica）是我國特有的杏屬栽培品種，屬于苦杏仁甙含量低仁用杏類型。杏仁食用價值大，不僅含有大量的糖類、蛋白質、脂類等營養成分，而且有豐富的銅、鋅、鉀、磷、鐵等無機微量元素及10多種維生素，是滋養補身的上佳果品。據2015年統計，全國杏扁種植面積超過約333 hm2，年產甜杏仁約合5.13萬t，出口甜杏仁1.0-1.5萬t，創匯居出口土特產首位［1］。杏扁種植在北方，屬于早花植物，早春開花時易受到低溫倒寒流的凍害，造成杏果的大量減產，嚴重時甚至顆粒無收，故凍害一直是杏扁的種植和生產的最大威脅［2-4］。自20世紀70年代開始，我國的研究者對杏扁的抗寒性生理機制進行了大量的研究，期望選育出抗凍害的優良樹種。可是杏扁的抗寒性受到內在生長發育時營養物質含量和外在栽培條件等因素的影響，僅僅通過生理指標的評判易造成誤差，導致抗寒育種進程緩慢。因此，要從根本上解決杏扁的抗寒性，需要從DNA水平上分析杏扁的遺傳背景，構建連鎖圖譜和抗寒性QTL研究。

自Weeden等［5］提出了“雙假測交”（Double pseudo test cross）的理論后，國內外的研究者對鮮食杏遺傳圖譜構建的研究取得了一定的進展。Hurtado等［6］利用AFLP、RAPD、RFLP和SSR標記，以‘Goldrich’בValenciano’雜交的F1代為作圖群體，構建了父母本的遺傳連鎖圖譜。Vilanova等［7］以‘Stark Early Orange’בTyrinthos’的F1代自交獲得的76株F2群體為材料，采用AFLP和SSR標記構建了杏的遺傳連鎖圖譜。國內，章秋平等［8］利用杏‘串枝紅’ב金太陽’的F1為作圖群體，采用SSR和SRAP標記構建了雙親的連鎖圖譜。然而，在杏扁遺傳連鎖圖譜構建方面的研究還未見報道。

本研究選用抗寒性差的‘龍王帽’授粉抗寒性強的‘優一’獲得的F1代為作圖群體，利用SRAP和SSR標記構建杏扁的遺傳連鎖圖譜，以期為杏扁的抗寒性QTL定位及分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗寒性強的品種‘優一’為母本，抗寒性差的品種‘龍王帽’為父本雜交產生的F1代為作圖群體。2015年春季去雄雜交，當年秋季采收獲種子，2016年早春催芽后進行種植。材料種植在張家口市農業科學院的仁用杏資源圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和F1雜種的鑒定 2017年春，采摘父母本和2年生F1代植株的嫩葉，采用本實驗室改良的CTAB［9］法提取DNA，稀釋到50 ng/μL后，貯存于-20℃冰箱備用。為保證作圖群體材料的真實性，選用5對具有父本特異性條帶的SRAP引物，對F1單株進行鑒定。

1.2.2 SRAP與SSR反應體系及擴增程序 實驗所用的SRAP引物采用Li和Quiros［10］公布的序列，SSR引物采用方閃閃［11］開發的杏扁SSR引物系列。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成。

SRAP-PCR反應體系：Taq酶1.5 U，Mg2+2.5mmol/L，DNA模板30 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.9 μmol/L，1×Buffer。PCR 反應程序：94℃預變性 5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，5個循環；94℃變性 1 min，52℃復性 1 min，72℃延伸1.5 min，28個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照記錄。

SSR-PCR反應中各組分濃度為：Mg2+1.5 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，Taq酶 1.5 U， 引 物濃 度 0.25 μmol/L，DNA 模 板 30 ng，1×Buffer。PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，Tm±2℃復性45 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，銀染后拍照分析。

1.2.3 分子連鎖圖譜的構建 根據“雙假測交”理論，參照梁小玉等［12］進行SRAP條帶的統計，每個位點用“引物組合+條帶大小”命名，將凝膠圖上擴增出的條帶記作“1”，沒有條帶記作 “0”，模糊不清或者缺失的記作“-”，然后按照JoinMap 4.0軟件CP模式將初始數據轉化為數據矩陣。SSR標記按照Join Map 4.0軟件中CP模式的要求對原始數據的進行記錄并整理，不清晰或無條帶的標記記為“-”。按照孟德爾分離規律，對F1群體所有條帶進行卡方（χ2）檢驗，顯著水平為0.01，將偏分離顯著的標記剔除。利用Join Map 4.0軟件對余下的標記進行遺傳連鎖分析，將LOD值設置為3.0-8.0運算，設置遺傳分析的參數最大重組率為r=0.4，通過Kosambi函數［13］將重組率轉換為圖距（cM），分別構建出父本和母本的分子遺傳圖譜。

2 結果

2.1 多態性引物篩選

以父母本的DNA為模板對374對SRAP引物及21對SSR引物進行擴增多態性篩選，SRAP標記選出65對能在父母本之間擴增出位點多樣、條帶清晰，并能夠重復試驗的引物，引物入選率為17.38%。SSR標記選出17對引物在父母本間表現出豐富的多態性，引物入選率為81%。

2.2 雜種鑒定

自篩出的SRAP引物中選取的5對能擴增出父本特異性條帶的引物組合。對122株雜種后代進行鑒定，以出現父本特異性條帶為標準，從122株子代中鑒定出98株為雙親雜交的真實子代，在田間對這98株子代個體的表觀特征進行復查，從而更加確定了這98株子代就是‘優一’ב龍王帽’真實的雜交子代。

2.3 SRAP及SSR標記的多態性和偏分離分析

SRAP標記擴增結果（圖1）：采用65對篩選出多態性良好的引物，對子代群體進行PCR擴增，總共檢測出標記位點234個，將這些位點分為3種類型統計：（1）np×nn分離類型，即父本為雜合基因型np，母本為純合基因型nn，子代孟德爾分離比為1∶1，屬于該類型的標記位點為41個，占多態性標記總數的17.52%。（2）lm×ll分離類型，即母本為雜合基因型lm，父本為純合基因型ll，子代孟德爾分離比為1∶1，屬于該類型的標記位點為96個，占多態性標記總數的41.03%。（3）hk×hk分離類型，即雙親均為雜合基因型hk，子代可能的基因型為h-和kk或hh和k-，孟德爾分離比為3∶1或1∶3，屬于該類型的標記位點為97個，占多態性標記總數的41.45%。平均每對引物組合擴增出3.6條多態性條帶。通過卡方（χ2）檢驗（α=0.01）發現：偏離孟德爾分離比的父本位點有12個，在所有的父本特異標記中占29.2%；偏離孟德爾分離比的母本位點有23個，在所有的母本特異標記中占23.9%；偏離孟德爾分離比的父母本共有的位點28個，在父母本共有的標記中占28.9%。

SSR標記擴增結果（圖2）：利用17對選出的SSR引物對作圖群體進行擴增，由于SSR引物較少，所以擴增出的結果只有np×nn和lm×ll兩種類型。其中屬于np×nn分離類型的有7個，占多態性標記總數的41.18%。屬于lm×ll分離類型的有10個，占多態性標記總數的58.82%。這兩種分離類型的孟德爾分離比均為1∶1。通過卡方（χ2）檢驗（α=0.01），有1個父本雜合位點出現偏離分離現象，占父本特有標記總數的14.3%；有1母本雜合位點出現偏離分離現象，占母本雜合位點總數的10%。

圖1 SRAP引物M4-E4擴增群體的電泳圖

2.4 分子遺傳圖譜的構建

本實驗共擴增得到234個SRAP標記和17個SSR標記，利用Join Map 4.0軟件中的CP 作圖模型，先將48個np×nn分離類型及97個hk×hk分離類型的標記位點進行連鎖分析，構建父本‘龍王帽’的分子連鎖圖譜，命名為M1-M8（圖3，表1），父本圖譜擁有8個遺傳連鎖群，共定位了53個SRAP標記位點以及9個SSR標記位點，圖譜的圖距總長度為694.8 cM，平均圖距為11.21 cM，相鄰位點間最小距離為0.6 cM，平均每個連鎖群上有7.75個標記位點，連鎖群平均長度為86.85 cM。

再利用106個lm×ll分離類型及97個hk×hk分離類型的標記位點進行連鎖分析，構建母本‘優一’的分子連鎖圖譜，命名為Y1-Y8（圖4，表2），母本圖譜同樣擁有8個遺傳連鎖群，定位了79個SRAP標記位點以及8個SSR標記位點，圖譜的圖距總長度為924.8 cM，平均圖距為10.63 cM，相鄰位點間最小距離為0.4 cM，平均每個連鎖群上有10.87個標記位點，連鎖群平均長度為115.6 cM。為了得到標記密度較高的圖譜在其中加入部分偏分離標記，此類位點在遺傳圖譜中用“*”標出。

圖2 SSR引物UDP96-008擴增群體的電泳圖

3 討論

親本的選擇和群體的創建是構建遺傳連鎖圖譜的基礎。本研究選取的雜交親本‘龍王帽’和‘優一’雖屬種內雜交，但杏扁屬于遺傳變異豐富且高度雜合的樹種，導致種內雜交所產生的F1代群體存在較高頻率的分離位點。“雙假測交”理論為高度雜合的木本植物遺傳圖譜的創建提供了理論依據，已被廣泛地應用于異花授粉植物F1群體的作圖中。與其它作圖群體相比，F1群體作圖節省時間且操作簡單，同時也避免了自交不親和的障礙。故本研究基于“雙假側交”策略對F1群體進行作圖，可視為回交群體模型來進行圖譜構建［14］。

前人研究表明，標記的偏分離在作圖過程中普遍存在［15，25］，且在連鎖圖中的比例一般在6.8%-31.8%之間［16］。本實驗對標記偏分離進行分析，獲得的234個多態性標記位點中，有65個標記屬于偏分離標記，在所有的多態性標記中占27.8%。依據大多數科研學者的共識，導致遺傳位點發生偏分離的主要因素如下：基因組在雜交時發生結構上的重排、缺失、插入和突變［17］，偏分離可能與群體類型有聯系［18］，環境因素、非同源重組、基因轉化和轉座子等因素［19］，葉綠體DNA、線粒體DNA等表現為母性遺傳的細胞質DNA［20］。

如何處理偏分離標記，絕大多數研究者認為可以將偏分離標記加入到圖譜構建中［21］。Bradshaw等［22］通過實驗證明，偏分離標記擁有與正常分離的標記同等效果的作圖效率，如果去除偏分離標記可能導致某些連鎖圖譜中連鎖群的基因失去連鎖關系。因此，較認同的作法是將偏分離的標記與正常分離的標記同等分析，如果能定位到圖譜上用“*”標出。本研究中，同樣也有16個偏分離標記被應用到遺傳連鎖圖圖譜的構建中，占作圖標記的11%。

一般認為，遺傳圖譜中的連鎖群上的標記間平均間隔不大于20 cM［23-24］。本研究構建的杏扁雙親2張圖譜中，母本8個連鎖群，標記間平均圖距為10.63 cM，父本也是8個連鎖群，標記間平均圖距為11.21 cM，達到了連鎖圖譜的基本要求。但本研究中父母本的連鎖群上的標記分布不均勻，這與分析時所采用的標記類型和數量偏少有關。今后我們應該擴大作圖群體，采用更多類型和數量的分子標記加密杏扁的遺傳圖譜。

4 結論

本研究采用篩選出的65對SRAP引物和17對SSR引物對杏扁‘龍王帽’ב優一’的F1代群體進行遺傳分析，在獲得了234個SRAP標記和17個SSR標記的基礎上成功構建了兩親本“龍王帽”和“優一”的遺傳連鎖圖譜。該結果為后續深入研究杏扁重要農藝性狀QTL定位奠定基礎。

圖3 父本‘龍王帽’的分子連鎖圖譜

圖4 母本‘優一’的分子連鎖圖譜

表1 父本‘龍王帽’遺傳圖譜連鎖群的主要參數

表2 母本‘優一’遺傳圖譜連鎖群的主要參數