來源于Alicyclobacillus sp.A4葡萄糖異構酶的克隆表達及轉化應用研究

戴晨霞 曹慧方 羅會穎 姚斌 柏映國 徐波

（1. 江西農業大學生物科學與工程學院，南昌 330045；2. 中國農業科學院飼料研究所，北京 100081）

高果糖漿（High fructose corn syrup，HFCS）又稱果葡糖漿，是一種主要成分為葡萄糖和果糖的液體甜味劑［1］，由玉米淀粉通過α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖異構酶的作用而生成的。高果糖漿相對于蔗糖具有甜度高、風味佳、溶解度高、價格低等優勢［2］，因此成為目前主要的甜味劑，廣泛應用于食品、醫藥等行業。近年來，國內外高果糖漿的需求量不斷增加，日本年消耗食糖總量為250萬t左右，而淀粉糖占其中的50% 以上；美國人均食糖消費69 kg/a，淀粉糖占38 kg/a 以上。我國由于大量外資食品企業的進入、食品工業的快速發展以及醫藥市場的大量開發，也極大地擴大了對高果糖漿產品的需求。

根據果糖含量，目前市場上常見的高果糖漿分為三種類型：HFCS-42（含 42% 的果糖）、HFCS-55（含55% 果糖）和 HFCS-90（含 90% 果糖）［3］。這三種濃度的高果糖漿被應用于不同的食品當中，HFCS-42主要用于烘培食品、灌裝水果、調味品、奶制品等行業，而HFCS-55多適用于一般的甜味飲料、碳酸飲料、雪糕、冰淇淋、冷凍甜點等，HFCS-90最主要還是用于制得HFCS-55［4］。

葡萄糖異構酶在體外可以將D-葡萄糖異構化D-果糖，是商業制備高果糖漿的關鍵酶制劑。由于商業葡萄糖異構酶效率低、不耐高溫等原因，目前工業生產的高果糖漿主要是HFCS-42［4-5］。HFCS-42果糖含量低，醫療和保健價值并不能得到充分發揮，且在低溫貯運時易結晶析出，所以HFCS-42也逐漸滿足不了市場的需求。相比較，HFCS-55果糖含量高，甜度和功能更好，且在低溫時不易結晶，更具有商業應用前景。但HFCS-55必須經過HFCS-42的色譜分離濃縮成HFCS-90，再將這兩者混合制得，生產技術成本高［6］。正因此，國內外還沒有直接生產HFCS-55的廠家。

提高轉化率以及轉化過程中的底物濃度（葡萄糖）是降低生產成本的有效途徑。已有研究表明，葡萄糖異構酶對D-葡萄糖的轉化率與溫度有相關性［7］，因此挖掘到一個耐熱的葡萄糖異構酶，是獲得高葡萄糖濃度下高果糖轉化率的關鍵，對工業生產55% 高果糖漿具有重大意義。

為挖掘一個在工業上制備高果糖漿具有應用價值的酶。本研究從高溫菌株Alicyclobacillussp.A4中克隆獲得一個新的葡萄糖異構酶基因A4GI，在大腸桿菌中進行表達，對已純化的蛋白酶學性質進行表征，最后對其轉化率進行研究，發現其在一個高的葡萄糖濃度下能達到較高的果糖轉化率，因此具有巨大的工業應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 脂環酸芽孢桿菌Alicyclobacillussp.A4［8］分離自云南保山地區溫泉水中，菌株及基因組保存于中國農業科學院飼料研究所，并已進行全基因組測序。E.coliTrans1 克隆宿主、E.coliBL21表達宿主及克隆載體pEASY-T3都來自北京全式金生物技術有限公司。pET30a表達載體保存于中國農業科學院飼料研究所。

1.1.2 試劑FastPfuDNA聚合酶（北京全式金生物）、LA Taq酶（TaKaRa公司）、質粒小提試劑盒（北京天根生物公司）、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細菌DNA提取試劑盒（都來自OMEGA公司）、His-tag蛋白純化磁珠（蘇州海貍生物公司）、蛋白定量試劑盒（北京全式金生物公司）、核酸Marker、蛋白 Marker（均來自 Genstar）、D-葡萄糖（sigma公司）、果糖、半胱氨酸鹽酸鹽、咔唑（均來自國藥集團有限公司）、其他化學試劑為進口或國產分析純。

1.1.3 培養基 LB培養基：1% 蛋白胨，0.5% 酵母粉，1% NaCl，121℃滅菌20 min。加入1.5% 的瓊脂粉即為固體LB培養基。

1.2 方法

1.2.1 A4GI的基因克隆與序列分析 以Alicyclobacillussp.A4基因組為模板，以A4GI-pET30a-F/R為前后引物（表 1），PCR擴增獲得A4GI基因，將其連接到pEASY-T3克隆載體，熱激轉化至E.coliTrans1克隆宿主中，菌落PCR對轉化子進行篩選，并測序。序列經NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數據庫Blastn、Blastx和Blastp進行比對與分析。再通過overlap的方法構建表達載體，將目的基因連接到含有6個組氨酸標簽的pET30a載體上。主要經過3輪PCR：第一輪PCR，以A4GI-pEASY-T3質粒為模板，以A4GI-pET30a-F/R為引物，獲得帶有pET30a載體重疊區的A4GI目的基因片段；第二輪PCR，以pET30a質粒為模板，以pET30a-A4GI-F/R為引物（表 1），擴增獲得帶有A4GI重疊區的pET30a載體片段；第三輪PCR，前兩輪PCR產物摩爾比為1∶1，互為模板互為引物，進行兩片段的PCR擴增連接。第三輪PCR產物即為重組表達載體A4GI-pET30a，并轉化至表達宿主E.coliBL21。

表1 基因克隆與載體構建所需的引物序列

1.2.2 表達與純化 將重組陽性轉化子培養至OD600值為0.6左右（約2-3 h）；加入終濃度為0.6mmol/L的異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30℃，200 r/min誘導培養5-6 h；菌液12 000 r/min離心10 min去除上清，根據菌體濕重將其重懸于適量的咪唑溶液NTA0（20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L 氯化鈉，0 mmol/L咪唑，pH 7.4）；利用冰浴超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。利用鎳離子磁珠純化蛋白：將A4GI粗酶液混入裝有經蒸餾水洗凈的磁珠的離心管中，將離心管于旋轉儀上旋轉2 h，使目的蛋白結合到磁珠上后；用3 mL 的濃度分別為40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L 和300 mmol/L的的咪唑溶液依次洗脫雜蛋白和目的蛋白（40-100 mmol/L 咪唑一般洗脫雜蛋白，200-300 mmol/L咪唑溶液一般洗脫目的蛋白）；洗脫結果經SDS-PAGE電泳檢測。分別將含有單一的目的蛋白洗脫液合并，并利用3 kD透析袋透析以除去咪唑。利用Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.3 酶活測定 標準反應體系：1 mol/L D-葡萄糖 50 μL，適當稀釋的酶液 50 μL，10 mmol/L Co2+50 μL，緩沖液（磷酸鹽緩沖液 pH 7.5）850 μL，65℃反應1 h，冰水浴終止反應，上述反應液稀釋20倍，吸取其中500 μL測定果糖的生成量。使用滅活的酶液作為對照。

果糖的測定：向反應稀釋液（500 μL）依次加入H2SO4溶液（450 mL H2SO4徐徐加入190 mL水中）3 mL，1.5%半胱氨酸鹽酸鹽溶液100 μL，0.12% 咔唑酒精溶液100 μL，混勻，60℃顯色10 min，冰水浴終止反應，于560 nm處測定吸光值。根據果糖標準曲線求得果糖的含量。

酶活定義：在酶活測定標準條件下，每分鐘產生1 μmol D-果糖所需要的葡萄糖異構酶的酶量被定義為一個酶活單位，用U表示。

1.2.4 重組A4GI的酶學性質

1.2.4.1 最適溫度、最適pH與穩定性 最適溫度測定：在磷酸緩沖液中（pH 7.5），測定A4GI在不同溫度下的酶活。在標準反應體系下，A4GI分別在50-80℃下反應1 h，冰水浴冷卻，測定果糖生成量，計算酶活，確定最適反應溫度。

最適pH測定：在之前測定的最適溫度下，測定A4GI在不同的pH緩沖液中的酶活。在標準反應體系下，A4GI在pH 5.0-9.0的緩沖液中反應1 h，冰水浴終止反應，測定果糖生成量，計算酶活，確定最適反應pH。

溫度穩定性測定：A4GI（含Co2+）分別在55、60和65℃下都孵育15、30 和60 min后，標準反應體系在最適溫度和最適pH 下測定剩余酶活，以初始酶活力為100%，計算出相對酶活，以確定溫度對酶穩定性的影響。

pH穩定性測定：經pH 5.0-13.0的緩沖液（含Co2+）稀釋的A4GI，37℃孵育1 h后，標準反應體系在最適溫度和最適pH 的下測定剩余酶活，以初始酶活力為100%，計算相對酶活。

1.2.4.2 金屬離子對酶活的影響 在酶活測定的標準條件下，在反應體系中加入終濃度為0.5 mmol/L Co2+的基礎上，再分別加入10 mmol/L不同的金屬離子及化學試劑（K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cr3+、Ca2+、Ni2+、Ag+、Zn2+、Fe2+、SDS、EDTA 和 β- 巰基乙醇），在最適溫度與最適pH下反應1 h，測定酶活。以在只有Co2+時的酶活作為對照。

1.2.4.3 動力學常數 在標準體系條件下，分別加入不同濃度的底物D-葡萄糖（10-60 mmol/L），在最適溫度和最適pH下反應1 h，冰水浴終止反應，測定果糖濃度，計算酶活。利用米氏方程進行雙倒數作圖，計算出動力學參數。

1.2.5 轉化率測定 3 mL的反應體系中，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），0.5 mmol/L Co2+，分別在底物葡萄糖濃度為0.1、0.5、1、2和3 mol/L 下測定轉化率，在每個底物濃度下加入相對應的足夠量的A4GI酶活單位（在葡萄糖濃度為0.1 mol/L 時，加入酶量6 U；其他濃度按比例加入相應酶量），65℃反應，每1 h取一次樣（100 μL），測定生成的果糖濃度，計算轉化率。轉化率即為生成的果糖的量與反應最初的底物葡萄糖的量之比。實驗重復3次，每次每個組分3個平行。

2 結果

2.1 基因克隆表達與序列分析

克隆獲得的重組葡萄糖異構酶的核酸序列長度為1 320 bp，編碼439個氨基酸。蛋白經鎳離子磁珠純化后，SDS-PAGE的鑒定結果（圖 1）顯示單一組分的重組蛋白，分子量大小在45 kD左右，與理論分子量一致，表明A4GI已成功克隆、表達并純化。已純化的異構酶經蛋白濃度和酶活測定，其比活計算得到為1.29 U/mg。A4GI氨基酸序列經NCBI數 據 庫 Blastn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，其氨基酸序列與來源于Alicyclobacillus hesperidum（登錄號為EJY54601）的GI的氨基酸序列相似性為100%。與PDB數據庫中來源于Bacilus Stearothermophilus的 GI（PDB ID：1A0D_A）相似性最高為73%，與ThermoanaerobacteriumThermosulfurigenesGI（PDB ID：1A0C_A）相似性次之，為68%。

圖1 A4GI重組蛋白SDS-PAGE 分析

2.2 酶學性質

2.2.1 最適反應條件及穩定性 重組A4GI經最適溫度、最適pH測定顯示，其最適溫度與最適pH分別為65℃與pH 7.5，在較高溫度70℃下還具有54%以上的酶活，但在75℃下幾乎失活。在pH 6.5-8.0具有69%以上的酶活，可應用于偏酸性條件（圖 2-A，2-B）。

以未處理時酶活為100%。熱穩定性測定結果（圖2-C）顯示，A4GI在55℃處理1 h，剩余酶活78% 以上；60℃處理1 h，剩余酶活50%；65℃處理1 h，幾乎完全失活，剩余酶活6%；說明A4GI在55℃及其以下，可以保持穩定的狀態。pH穩定性測定結果（圖2-D）顯示，A4GI展現出寬泛的pH穩定性，在pH 6.0-11.0的緩沖液中37℃處理1 h，保持99% 以上的酶活，相當的穩定。

2.2.2 金屬離子對酶活的影響 當在酶促反應體系中不加入任何離子時，A4GI葡萄糖異構酶的活性很低。但當加入微量的Co2+時，酶活得到了極大的提高。酶促反應體系中在含有Co2+離子的情況下，測定其他金屬離子對酶活的影響結果（表 2）顯示，K+也有略微激活作用（10% 以上）。Na+、Mg2+對酶活性沒有明顯的影響，酶活在10% 以內波動。而大多數金屬離子與化學試劑，像Fe2+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Cr3+、Mn2+、EDTA 和 SDS 對酶 A4GI有嚴重的抑制作用，酶活在30% 以下。

2.2.3 動力學常數 在D-葡萄糖濃度為10-60mmol/L下測定了A4GI的動力學。動力學參數通過米氏方程雙倒數曲線（方程式：y=26.638x+0.2669，擬合度：R2=0.997 8）計算得到，A4GI的Km、Vmax和Kcat/Km值分別為 99.8 mmol/L、3.75 μmol·min-1·mg-1和 1.87 min-1·mmol·L-1。Km值越低，表示酶對底物的親和力越高。Kcat/Km值越大，表示酶對底物的催化效率越高。

2.3 A4GI的轉化率研究

在測定不同底物濃度下A4GI的轉化率的結果如圖3所示，A4GI具有優良的底物耐受性，在一定底物濃度范圍內（0.1-3 mol/L D-葡萄糖），A4GI的最大轉化率隨著底物濃度的增具有升高的趨勢；底物濃度越高，反應的平衡點右移，生成的果糖越多；在D-葡萄糖濃度為3 mol/L時，A4GI在第3小時達到最大轉化率為52.7%。

圖2 A4GI最適反應條件及穩定性

表2 不同金屬離子及化學試劑對A4GI酶活的影響

圖3 A4GI在不同葡萄糖濃度下的轉化率

3 討論

為了能篩選到一株具有高轉化率的葡萄糖異構酶，本研究從Alicyclobacillussp.A4高溫菌株中分離出葡萄糖異構酶基因，并在大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3）中進行表達。Alicyclobacillussp.A4菌株是從云南省的一個熱溫泉中分離出來的一株高溫菌。大部分來源于這株菌的酶，最適溫度基本都在55-70℃左右，像木聚糖酶［8］、β-1-4-葡聚糖酶［9］、α-半乳糖苷酶［10］等。這是首次克隆表達來自于這株菌株中的葡萄糖異構酶，A4GI的最適溫度為65℃。大部分葡萄糖異構酶的最適溫度都在60-80℃之間。例如，來自于Thermobifida fuscaWSH03-11的葡萄糖異構酶被在大腸桿菌中表達，其最適溫度為80℃［11］。來自于Thermoanaerobacter thermosulfurigenes的 GI最適溫度為 65℃［12］。來自于Streptomyees olivaceoviridisE-86的葡萄糖異構酶的最適溫度為60℃［13］。但是近幾年由于對高溫葡萄糖異構酶的迫切需求，已有很多超高溫酶被發現，像通過基因挖掘的Thermoanaerobacter ethanolicusCCSD1（TEGI）葡萄糖異構酶最適溫度為 90℃［14］。Thermotoga neapolitana5068葡萄糖異構酶最適溫度在95-100℃之間［15］。同樣通過基因挖掘，來自于Thermus oshimai的葡萄糖異構酶的最適溫度高達95℃［16］。雖然很多葡萄糖異構酶的最適溫度高達90℃以上，但過高的溫度用于生產會消耗能源，增加生產成本［10］。另外，超高溫也容易使底物與產物熱變質，以及在異構化過程中產生更多的副產物［17］。本研究中經最適pH測定后，顯示A4GI是中性酶，最適pH為7.5。這和大多數研究者的結果是相似的，來 自 于Thermoanaerobacterium saccharolyticum［18］、Actinoplanes missouriensisCICIM B0118（A）［19］、Thermoanaerobacterstrain B6A［20］、Streptomyces griseus［21］等的葡萄糖異構酶的最適pH都是7.0-7.5之間。但在葡萄糖到果糖的異構化反應中，不僅溫度對果糖的產量有影響，反應體系的pH也很重要。工業化應用需要在一個微酸性的pH環境下，以減少堿性條件下產生的褐變反應及副產物［22］。但是大多數商業的葡萄糖異構酶的最適pH在7.5-9.0之間，并且在酸性條件下，酶活大大的下降。A4GI在pH 7.0時具有95% 的酶活，在pH 6.5時具有69% 的酶活，利用這一點也許可以解決上述問題。本研究中A4GI在 55℃以下較穩定，在其最適溫度65℃時穩定性較低，這是因為最適溫度測定是在具有底物的環境中測定的，底物的存在有助于穩定酶的三維構象，因此有很多酶表現為最適溫度高于穩定性溫度［23-24］。A4GI熱穩定性較低也可能是其轉化率沒有達到55% 以上的原因［7］，因此在后期實驗中利用蛋白分子改造技術提高其熱穩定性是有必要的。但A4GI有寬泛pH穩定性。A4GI在pH 6.0-11.0處理1 h，仍剩余99%以上的酶活。相比較于已報道過的葡萄糖異構酶，A4GI展現出很好的pH穩定性。葡萄糖異構酶的最適底物是D-木糖，對葡萄糖的Km值一般要比對木糖的大很多。A4GI對底物葡萄糖的Km值分別是99.8 mmol/L，低于大部分已報道的GIs， 像Thermobifida fusca［11］、Thermoanaerobacter ethanolicus［14］、Thermoanaerobacterium saccharolyticum［18］、Thermoanaerobacterstrain B6A［20］的Km值分別為 197、421、199和120 mmol/L。這表明A4GI對底物親和力高，具有工業應用潛力。

葡萄糖異構酶一般都需要二價金屬離子Mg2+、Co2+和Mn2+或這3種離子的組合，來獲得最大酶活。Mg2+主要起激活劑的作用，Co2+主要是穩定酶的構象［25］。像來源于Streptomycessp.的葡萄糖異構酶在加入Mg2+情況下，酶活顯著提高［26］。來源于Thermoanaerobacterstrain B6A菌株中的葡萄糖異構酶需要Mg2+和Co2+［19］。本研究中，A4GI 活性需要Co2+來激活，并且被Ca2+、Ni2+抑制。這與前人研究報道是相似的，是由于Mg2+、Co2+、Mn2+和Fe2+的金屬離子半價≤0.8?，而堿土金屬離子Ca2+、Ba2+和 Sr2+和過渡金屬離子 Hg2+、Pb2+、Ni2+、Cu2+和Cd2+的離子半價較大［27-28］。

葡萄糖異構酶作為重要的工業酶之一，被廣泛應用于高果糖漿的生產?，F在商業的葡萄糖異構酶因效率較低，主要用于生產HFCS-42，很難達到一步法生產HFCS-55［22］。所以到目前為止，55% 的高果糖漿的生產只能通過HFCS-42進一步的純化濃縮獲得［29］，使生產成本居高不下。根據高溫使底物到產物的平衡點右移的原理，篩選一株嗜熱的葡萄糖異構酶是一步法獲得55% 的高果糖漿的一種可行的辦法［7，30］。本研究立足于這一點，從Alicyclobacillussp.A4高溫菌株中挖掘并從它們的基因組中分離出葡萄糖異構酶基因。在轉化率研究中，A4GI在葡萄糖底物濃度為3 mol/L 時，轉化率先升高后下降，下降的原因是因為葡萄糖到果糖的反應是一個可逆反應造成的，最高轉化率達到52.7%。相比于前人的報道，這是首次在高濃度底物下達到52.7% 的轉化率。賈東旭等［16］在2017年報道了來源于Thermus oshimai菌株的葡萄糖異構酶在底物濃度為400 g/L時，85℃反應轉化率為52.16%，并且該研究作者分析可能是異構化溫度太高而產生過多的副產物，影響了果糖的產量。J?rgensen等［31］也提出高溫反應過程中一小部分葡萄糖會降解，一些副產物甘露糖、阿洛酮糖、酸性化合物將生成，從而使反應體系顏色變化。來源于Thermobifida fuscaWSH03-11的葡萄糖異構酶在45%（質量體積比）葡萄糖底物濃度下，最大轉化率為53%［11］。來源于Streptomycessp.的葡萄糖異構酶在較低的葡萄糖濃度下（質量體積之比為30%），轉化率為55%［24］；該酶的最適pH是11.0，在pH 8.0時只有60% 的酶活。來源于Thermoanaerobacter ethanolicus的野生型和突變體葡萄糖異構酶在10% 葡萄糖濃度下，轉化率分別為53.8% 和 55.4%［14］。廖承軍等［32］在 2015 年報道的Thermotoga petrophilaGI也在10% 的葡萄糖濃度下，轉化率為53.8%。這些報道中有部分葡萄糖異構酶達到55%的轉化率，但其都是在較低的葡萄糖濃度下（低于3 mol/L 葡萄糖）測定的，且沒有關于轉化率與底物濃度之間的關系的描述。本研究結果顯示，A4GI異構酶的最大轉化率隨著底物濃度的增加呈升高趨勢，這結果和前人報道有些不同，像來自于Thermus oshimai的GI在50-500 g/L的底物濃度下，果糖轉化率呈現先升高后下降的趨勢［4］，這說明A4GI具有較強的底物耐受性。并且A4GI在3mol/L 的葡萄糖濃度下達到52.7%的 高轉化率，不管是在高果糖漿的生產還是在其產品（干物質為70%）形成中都能有效地減少成本。

4 結論

從Alicyclobacillussp.A4菌株中克隆一葡萄糖異構酶基因A4GI，并成功進行原核異源表達。對純化的重組A4GI進行基本酶學性質與應用轉化率測定。A4GI最適溫度為65℃，最適pH為7.5，需要Co2+輔助異構化反應，在55℃ 以下及pH 6.0-11.0之間相當穩定，對底物葡萄糖的Km、Vmax值分別為99.8 mmol/L 和3.75 U/mg。在一定底物濃度下，A4GI轉化率呈現升高的趨勢，在3 mol/L 葡萄糖濃度下達到最高為52.7%。