臍帶間充質干細胞對膿毒癥小鼠的器官保護作用及其機制

姜琳瑞，王小燕，張群，張書勤，楊靜，王紅，胡華鐘

膿毒癥(sepsis)是由感染引起的病原體與宿主免疫細胞之間復雜的相互作用及其伴隨的全身炎癥狀態[1]，其特征為感染反應失調所致的危及生命的器官功能障礙[2]。免疫反應作用對于抗感染至關重要，同時也是炎癥組織浸潤和器官嚴重損傷的主要原因[3-4]。調節促炎因子和抗炎因子有助于抑制免疫效應細胞，減輕全身炎癥反應，并緩解內毒素造成的組織損傷[5]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有調節先天免疫和適應性免疫反應的能力[6]，有潛在的抗炎特性，可用于治療炎癥和組織損傷相關的疾病[7-8]。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有高自我更新、高分化潛能、低免疫原性和調節免疫的特點，來源廣泛，便于取材，可大規模獲取、培養，且無倫理限制[9]，在細胞移植治療方面優于其他來源的MSCs，有更高的臨床應用價值。本研究采用hUCMSCs進行膿毒癥小鼠的細胞移植治療，探討hUCMSCs對細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的膿毒癥模型炎癥反應的調節作用，以及對受損器官的保護作用，以期為探索hUCMSCs治療膿毒癥的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 6～8周齡C57BL/6小鼠，體重25～30g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，自由進食、飲水，常溫環境飼養。白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；IL-10多克隆抗體、TNF-α多克隆抗體購自美國ABclonal公司；LPS(大腸埃希菌O111:B4提取物)購自美國Sigma公司；Synergy HTX多功能酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 膿毒癥小鼠模型的建立 腹腔注射LPS建立膿毒癥小鼠模型。取80只C57BL/6小鼠，隨機均分為4組，分別于腹腔注射5、10、20mg/kg LPS及等劑量PBS。于0h、6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d時間點測量各組小鼠體溫并觀察其活動狀態，確定最佳建模條件。最終確定造模用LPS劑量為10mg/kg。

1.3 hUCMSCs的培養與鑒定 臍帶獲取自所在醫院正常新生兒，簽署知情同意書，且經該醫院倫理委員會批準。取臍帶華通氏膠基質，剪碎為2.0mm3的組織塊，加入終濃度為0.05%的膠原酶Ⅱ，于37℃恒溫振蕩器中消化0.5h；消化完成后，加入PBS稀釋并過濾；濾液離心，用DMEM/F12完全培養基重懸，以1×106/cm2接種于T-25cm培養瓶中；3d后全量換液；待細胞匯合度達到80%～90%時，用0.25%胰酶消化處理，按1:3比例傳代。采用流式細胞儀檢測所得細胞表面標志(CD105、CD90、CD73/CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR)及成骨(茜素紅染色)和成脂(油紅O染色)誘導分化鑒定。按照國際細胞治療學會間充質及組織干細胞委員會提出的陽性標志物表達率≥95%、陰性標志物≤2%的標準對檢測結果進行鑒定。選取第3代細胞用于實驗。

1.4 分組及樣本采集 另取C57BL/6小鼠29只，隨機分為對照組(n=5)、LPS組(n=12)和hUCMSCs組(n=12)。對照組腹腔注射生理鹽水0.5ml，1h后尾靜脈注射PBS 0.5ml；LPS組腹腔注射LPS 10mg/kg，1h后尾靜脈注射PBS 0.5ml；hUCMSCs組腹腔注射LPS 10mg/kg，1h后尾靜脈注射2.5×105個hUCMSCs。分別在給予細胞治療后3、6、12、24h采用5%水合氯醛麻醉小鼠，心臟采血，取血清保存于–80℃。迅速開胸、開腹摘取肝臟、腎臟和肺組織，置于4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)中固定，制成石蠟切片。

1.5 病理形態觀察 細胞治療后6h，進行肺、腎、肝組織切片并行HE染色，觀察病理形態學變化。

1.6 炎癥因子表達水平測定 對以上各時間點肝組織切片進行IL-10、TNF-α免疫組化檢測，應用Image J軟件分析肝組織炎癥因子表達情況。采用ELISA法測定血清TNF-α和IL-10水平，按照試劑盒說明書操作，根據450nm處吸光度(OD)值計算炎癥因子血清濃度。

1.7 統計學處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5.0進行統計處理和構圖。計量資料用±s表示，驗證方差齊性。多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)；兩個獨立樣本的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hUCMSCs的培養與鑒定 倒置顯微鏡下可見細胞大小均一，折光性強，貼壁率高，呈長梭形漩渦狀排列，生長特征穩定，符合MSCs特性(圖1A)。MSCs的陽性表面標志物(CD73、CD105、CD90)和陰性表面標志物(CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR)檢測結果見圖1B。hUCMSCs經成脂分化誘導培養基誘導培養3周后，油紅O染色鑒定結果如圖1C所示，與未經誘導的細胞比較，誘導后的hUCMSCs染色后出現大小不一的小脂滴，表明hUCMSCs經誘導后可形成脂肪細胞，具有成脂分化潛能。hUCMSCs經成骨分化誘導培養基誘導培養4周后，茜素紅染色鑒定結果如圖1D所示，與未經誘導的細胞比較，誘導后的細胞可形成鈣結節，被茜素紅染成深紅色，表明hUCMSCs經誘導后可形成成骨細胞，具有成骨分化潛能。上述結果均符合間充質干細胞的鑒定要求。

圖1 人臍帶間充質干細胞的鑒定Fig.1 Identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs)

2.2 hUCMSCs對膿毒癥小鼠肺、肝、腎病理結構的影響 HE染色結果顯示，對照組小鼠肝臟、腎臟、肺組織未見明顯異常改變。LPS組小鼠肺部有肺泡毛細血管充血、肺泡腔炎性細胞滲出浸潤和肺泡壁增厚，肺泡間隔變粗，纖維增生；肝組織肝索紊亂，肝小葉結構不清晰，大量炎癥細胞聚集在門脈區和肝竇內，可見炎性細胞浸潤和肝細胞空泡變性等異常改變；腎臟有炎性細胞浸潤，腎小球毛細血管擴張、充血，球囊間隙變窄，腎小管上皮細胞有水腫。hUCMSCs組小鼠上述癥狀均得到有效緩解，提示hUCMSCs對膿毒癥小鼠的多器官損傷有保護作用(圖2)。

2.3 hUCMSCs對膿毒癥小鼠肝組織炎癥因子分泌的影響 與對照組比較，LPS組各時間點小鼠肝組織促炎因子TNF-α表達明顯升高，經hUCMSCs治療后TNF-α表達與LPS組比較明顯降低(P＜0.05，圖3)。與對照組比較，LPS組肝組織抗炎因子IL-10表達在3h達峰值，此后逐漸降低，但6h時仍明顯高于對照組，而12、24h時明顯低于對照組；經hUCMSCs治療后IL-10表達與LPS組比較明顯升高(P＜0.05，圖4)。

2.4 hUCMSCs對膿毒癥小鼠外周血清炎癥因子水平的影響 與對照組比較，LPS組小鼠血清TNF-α有上升趨勢，于12h差異有統計學意義(P＜0.05)；血清IL-10也存在上升趨勢，且于6、12、24h時差異有統計學意義(P＜0.05)。經hUCMSCs治療后3、6、12、24h，TNF-α水平均下降，但與同時間點LPS比較，僅24h時差異有統計學意義(P＜0.05)。hUCMSCs組IL-10水平在治療后各時間點均高于對照組，且在3、6、12h明顯高于LPS組(P＜0.05，表1)。

圖2 小鼠肺、腎、肝組織的病理學改變(HE ×200)Fig.2 Pathological changes of lung, kidney and liver in mice (HE ×200)Bar=5μm

圖3 小鼠肝臟組織TNF-α表達的免疫組化分析Fig.3 Immunohistochemical analysis of TNF-α expression in liver tissue of mice

圖4 小鼠肝臟組織IL-10表達的免疫組化分析Fig.4 Immunohistochemical analysis of IL-10 expression in liver tissue of mice

表1 小鼠血清IL-10、TNF-α水平的變化(pg/ml，±s，n=3)Tab.1 Changes of IL-10 and TNF-α levels in serum of mice(pg/ml, ±s, n=3)

表1 小鼠血清IL-10、TNF-α水平的變化(pg/ml，±s，n=3)Tab.1 Changes of IL-10 and TNF-α levels in serum of mice(pg/ml, ±s, n=3)

(1)P＜0.05 compared with control group, (2)P＜0.05 compared with LPS group

Group TNF-α IL-10 Control 88.183±4.359 60.344±27.057 LPS 3h 89.806±27.775 1026.821±300.728 6h 83.404±26.694 2103.175±131.424(1)12h 104.534±17.336(1) 310.745±16.234(1)24h 78.300±4.338 655.099±53.343(1)hUCMSCs 3h 75.340±9.687(1) 2805.620±300.728(1)(2)6h 67.511±8.668(1) 602.620±2.319(1)(2)12h 62.675±2.136(1) 465.411±14.213(1)(2)24h 88.183±4.359(1)(2) 293.763±21.646(1)

3 討 論

膿毒癥的特點是感染引起全身炎癥狀態，巨噬細胞被激活，釋放大量的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-1β，內源性促炎細胞因子過度活躍且促炎和抗炎細胞因子失衡，伴隨凝血途徑的廣泛激活，導致多器官衰竭、循環系統崩潰甚至死亡[10-11]。多器官功能衰竭是膿毒癥患者最主要的死亡原因，而肝、腎、肺組織是膿毒癥早期最常見的受損器官[12-13]。因此，針對性治療器官衰竭和炎癥因子紊亂是糾正膿毒癥的關鍵。

有研究表明，MSCs可調節血液中促炎/抗炎因子的水平，從而改善局部和全身炎癥反應，提高膿毒血癥小鼠的生存率[14]。不同來源的MSCs可減輕內毒素誘導的嚙齒類動物的肺臟損傷，主要通過抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子發揮治療作用，同時，MSCs可以遷移至肺部受損組織，并在受損部位分化為肺細胞表型[15-17]。研究發現，骨髓MSCs可促進免疫細胞產生抗炎細胞因子，如IL-10和TGF-1等，從而影響免疫細胞的分化、成熟和功能。而IL-10是公認的抗炎細胞因子，且已被證明在保護身體免受炎癥過度傷害方面發揮重要作用[18]。

與其他來源的MSCs相比，hUCMSCs不僅具有較高的自我更新能力和較低的免疫原性，還可通過非侵入性程序獲得，且易于培養，這使其在細胞移植治療方面優于其他來源的MSCs。本研究表明，靜脈注射hUCMSCs可以減輕膿毒癥小鼠的肝、腎、肺組織損傷，調節肝組織及外周血中抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α的表達，從而起到一定的改善膿毒癥的作用。本研究結果與相關文獻報道一致，提示hUCMSCs可有效糾正膿毒癥小鼠的免疫系統紊亂及減輕組織損傷，對膿毒癥具有一定的治療作用。

有研究認為，骨髓MSCs在缺乏單核細胞和巨噬細胞的小鼠中不再有效[19]。但根據本實驗結果，hUCMSCs可對肝臟中促炎/抗炎因子起到明顯的調節作用，結合相關文獻，肝臟內巨噬細胞是介導天然免疫和獲得性免疫的關鍵免疫細胞，它的激活可釋放大量的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-1β，并且與侵襲后的炎癥反應有關，在全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征的發生過程中起著關鍵作用[18]，因此hUCMSCs作用的發揮可能是基于與肝臟巨噬細胞的相互作用；而MSCs可通過與局部組織間的接觸和可溶性因子的旁分泌作用來保護組織[20]。hUCMSCs是通過自身遷移到達受損器官中分化而發揮作用，還是注入體內后通過旁分泌作用發揮療效還需探究，其對膿毒癥的具體作用機制也尚未明確，均有待進一步研究。