雙酚A對腔前卵泡體外發育的干擾作用

王喜艷，孫艷美，何海，齊孟飛，邱新茹，潘曉燕

雙酚A(bisphenol A，BPA)是世界上使用最廣泛的工業化合物之一，主要用于生產環氧樹脂和聚碳酸酯等材料。2003－2004年，美國健康和營養調查協會對6歲以上不同年齡和性別的2517名被調查者進行了尿樣檢測，結果在95%以上的受檢者尿樣中檢測到BPA。BPA結構類似于雌二醇(estradiol，E2)，具有弱的雌激素活性，其在機體中發揮作用的方式與雌激素相似，主要通過與靶細胞上的雌激素受體結合發揮調控細胞的功能。研究發現，動物接觸較高濃度的BPA后，其生殖系統的發育和功能會受到嚴重影響[1-4]。還有研究發現，不孕婦女尿液中高濃度的BPA與其原始卵泡數量降低密切相關[5]。BPA作為一種內分泌干擾物可干擾卵巢的卵泡發育[6-7]，但其作用和劑量尚不明確。本研究以小鼠腔前卵泡的體外發育為研究系統，使腔前卵泡在體外培養過程中接觸不同濃度的BPA，系統地檢測BPA對腔前卵泡中卵母細胞和顆粒細胞生長發育的干擾作用，旨在為確定BPA對女性生殖健康的影響提供有價值的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 D14昆明小白鼠60只，雌性，清潔級，購自吉林大學實驗動物中心。隨機分為正常組、對照組、4.5μmol/L BPA組和45μmol/L BPA組。正常組小鼠腔前卵泡的培養液為正常培養液，對照組小鼠腔前卵泡的培養液中添加1μl/ml DMSO，4.5μmol/L BPA組和45μmol/L BPA組小鼠腔前卵泡的培養液中分別添加4.5μmol/L BPA和45μmol/L BPA。

1.2 腔前卵泡體外培養 頸椎脫臼法處死小白鼠，迅速取其雙側卵巢置于含10%FBS的L-15工作液(Gibco公司，美國)中。體視鏡下去除卵巢周圍組織，機械分離出腔前卵泡。根據Pedersen和Peter的分級標準[8]，選取5a類卵泡進行培養。5a類卵泡包含一個圓的、被透明帶包繞的、位于整個卵泡中間的卵母細胞，2～4層顆粒細胞，完整的基膜以及附著在基膜上的若干卵泡膜細胞。將挑選的卵泡放在含有不同濃度BPA(0、4.5、45μmol/L)的α-MEM培養液(含5%FBS，1%ITS和0.1U/ml r-FSH)中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。次日測量腔前卵泡的直徑，選取直徑為110～160μm的卵泡繼續培養10d，觀察并記錄各組卵泡生長情況，統計卵泡的成腔率和裸卵率，測定卵泡的直徑和顆粒細胞層厚度。第10天在α-MEM培養液中添加2.5U/ml人絨毛膜促性腺激素(human choionic gonadotophin，hCG)，繼續培養16h后，去除卵丘卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes，COCs)周圍的顆粒細胞，倒置顯微鏡下觀察并記錄卵母細胞的成熟情況。

1.3 ELISA法檢測培養液中E2水平 分別收集第4、8、10天的卵泡培養液，采用ELISA檢測試劑盒(GS-C5401，上海安迪生物科技有限公司)測定培養液中E2水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4 免疫熒光法檢測卵泡中卵母細胞的雌激素受體表達水平 收集D10卵泡，去除顆粒細胞，將卵母細胞在4%多聚甲醛中固定1h，0.01mol/L PBS(pH 7.0～7.2)洗3次，5min/次，把固定好的卵母細胞移入封閉液(含1%BSA、0.01% Triton-X100的PBS)中封閉1h。然后將卵母細胞放到雌激素受體抗體(BS-0174R，武漢博士德生物科技有限公司)中孵育1h。經PBS洗滌3次后，將卵母細胞移到羊抗兔FITC標記的二抗(bs-0295G-FITC，武漢博士德生物科技有限公司)中，37℃孵育1h，5μg/ml hochest33342常溫孵育10min。將標記好的卵母細胞移到載玻片上，在Olympus IX73熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 Western blotting檢測卵泡中生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF-9)和骨形態發生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP-15)的表達 每個實驗組取體外培養D10的卵泡各80個，用RIPA強裂解液(含1%PMSF)提取蛋白。制膠，上樣，100V恒壓電泳約90min，300mA濕轉膜45min，5%脫脂奶粉封閉1h，然后將膜在兔源GDF-9抗體(bs-4720R)、BMP-15抗體(bs-6612R)和β-actin抗體(bs-0061R，均購自武漢博士德生物科技有限公司)中4℃孵育過夜。次日，將膜在HRP標記的羊抗兔二抗中室溫孵育2h。然后將轉有蛋白的PVDF膜放入Chemi DOC XRS+成像系統中，覆上增強顯影液，用Image Lab 3軟件進行拍照，Image J軟件對圖像進行灰度值分析。

1.6 統計學處理 卵泡直徑和顆粒細胞層厚度采用Image Pro-Plus 6.0進行測量分析。所有數據以±s表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(oneway ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BPA對腔前卵泡體外生長的影響 從D14小鼠卵巢中分離出腔前卵泡，采用倒置顯微鏡觀察其在D2、D4、D6、D8和D10的生長狀態。結果顯示，各組卵泡在D2開始貼壁生長；D4和D6卵泡的顆粒細胞開始向外擴展，且卵泡體積不斷增大；D8開始出現卵泡腔；D10卵泡腔的體積增加到最大(圖1)。與正常組比較，45μmol/L BPA組腔前卵泡的成腔率和卵母細胞成熟率(圖2、表1)明顯降低(P＜0.05)，而裸卵率明顯增加(P＜0.05，表1)；且與對照組比較，45μmol/L BPA明顯降低了D10卵泡直徑和顆粒細胞層厚度(P＜0.05，表2)，但其他各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 腔前卵泡體外發育過程(倒置顯微鏡，標尺=100μm)Fig.1 The development process of preantral follicles in vitro (Inverted microscope, bar=100μm)

圖2 體外培養D10卵丘卵母細胞復合體和卵母細胞觀察(倒置顯微鏡)Fig.2 Cumulus oocyte complexes (COCs) and oocytes at the 10th day of culturing in vitro (Inverted microscope)

表1 體外培養卵泡的成腔率、裸卵率和卵母細胞成熟率(%，±s，n=500)Tab.1 Percentages of antral follicles, denuded oocytes and matured oocytes during cultivation in vitro (%, ±s, n=500)

表1 體外培養卵泡的成腔率、裸卵率和卵母細胞成熟率(%，±s，n=500)Tab.1 Percentages of antral follicles, denuded oocytes and matured oocytes during cultivation in vitro (%, ±s, n=500)

(1)P＜0.05 compared with normal group

Group Percentage of antral follicles Percentage of denuded oocytes Percentage of matured oocytes Normal 92.6±4.9 2.1±0.1 80.3±8.6 Control 90.7±6.4 2.7±0.8 74.5±12.7 4.5μmol/L BPA 91.8±4.6 3.5±0.5 75.5±10.1 45μmol/L BPA 10.1±5.6(1) 28.6±3.8(1) 60.0±3.1(1)

表2 體外培養D10卵泡直徑和顆粒細胞層厚度(μm，±s，n=20)Tab.2 Diameter of follicles and thickness of cumulus cell layers at the 10th day of cultivation in vitro (μm, ±s, n=20)

表2 體外培養D10卵泡直徑和顆粒細胞層厚度(μm，±s，n=20)Tab.2 Diameter of follicles and thickness of cumulus cell layers at the 10th day of cultivation in vitro (μm, ±s, n=20)

(1)P＜0.05 compared with normal group

Group Diameter of folliclesThickness of cumulus cell layers Normal 633.5±60.2 561.1±51.3 Control 629.2±63.4 553.5±56.1 4.5μmol/L BPA 627.8±66.1 554.6±57.6 45μmol/L BPA 421.2±55.7(1) 310.4±43.3(1)

2.2 BPA對卵泡分泌E2的影響 分別收集各組D4、D8和D10的卵泡培養液，采用ELISA法檢測卵泡培養液中E2的含量，結果顯示，45μmol/L BPA對D4卵泡培養液中E2水平沒有明顯影響(P＞0.05)，但明顯降低了D8和D10卵泡培養液中E2水平(P＜0.05)；而4.5μmol/L BPA組E2水平與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05，表3)。

2.3 BPA對卵母細胞雌激素受體表達的影響 采用免疫熒光染色法檢測D10卵母細胞中雌激素受體的表達情況，結果顯示，雌激素受體主要表達在細胞膜和細胞質中(圖3A)。與正常組比較，4.5μmol/L BPA組卵母細胞雌激素受體的表達無明顯差異(P＞0.05)，而45μmol/L BPA組卵母細胞雌激素受體的表達明顯降低(P＜0.05，圖3B)。

表3 D4、D8和D10卵泡培養液中E2水平(ng/L，±s，n=5)Tab.3 Contents of E2 in the follicle culture media at the 4th,8th and 10th day (ng/L, ±s, n=20)

表3 D4、D8和D10卵泡培養液中E2水平(ng/L，±s，n=5)Tab.3 Contents of E2 in the follicle culture media at the 4th,8th and 10th day (ng/L, ±s, n=20)

(1)P＜0.05 compared with normal group

Group D4 D8 D10 Normal 13.70±0.83 14.84±0.31 21.00±1.16 Control 13.27±1.40 13.98±0.53 20.55±1.10 4.5μmol/L BPA 12.00±0.91 12.73±0.72 20.59±2.67 45μmol/L BPA 13.23±0.74 10.93±1.68(1) 14.58±5.29(1)

2.4 BPA對卵母細胞GDF-9和BMP-15表達的影響

收集D10卵泡，采用Western blotting檢測卵泡中GDF-9和BMP-15的表達，結果顯示，與對照組比較，45μmol/L BPA明顯降低了卵母細胞GDF-9和BMP-15的表達(P＜0.05)，而4.5μmol/L BPA對GDF-9和BMP-15的表達無明顯影響(P＞0.05，圖4)。

圖3 培養D10卵母細胞雌激素受體的表達Fig.3 Expression of estrogen receptor at the 10th day

圖4 培養D10卵泡GDF-9和BMP-15蛋白表達Fig.4 Protein expression of GDF-9 and BMP-15 in follicles at D10

3 討 論

美國食品和藥品監督管理局確定人類每天BPA的攝入耐受劑量不超過50μg/kg[9]。但是人們在更多的動物實驗中發現低于50μg/(kg·d)的BPA也會對動物健康產生明顯的不良影響，尤其是生殖系統[10]。Hunt等[11]的研究指出，不應簡單地把BPA僅僅當做一種有毒的化合物，因為BPA具有弱的雌激素活性，而激素類物質在劑量較高時僅能抑制人體的某些反應，在低劑量時反而會發揮較強的毒性作用。因此，2008年4月17日，美國國立衛生研究院決定，重新考慮BPA的安全劑量。目前一些國家正在對人類接觸的BPA安全濃度范圍進行更加科學、嚴謹的研究，在這一安全濃度確定之前，有必要在動物實驗中研究BPA對雌性生殖的影響及其作用機制。

本研究將體外分離獲取的小鼠腔前卵泡分別培養在含有不同濃度BPA的培養液中，結果發現，45μmol/L BPA明顯抑制了腔前卵泡的生長發育，大多數腔前卵泡直徑和顆粒細胞層厚度增加不明顯，培養后期無卵泡腔形成，最終導致成熟的M2期卵母細胞數量明顯減少，提示45μmol/L BPA抑制了顆粒細胞增殖，干擾了卵泡的體外發育。Zhou等[12]在大鼠卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞的體外培養液中添加BPA，發現100μmol/L BPA明顯抑制了卵泡膜細胞和顆粒細胞的增殖。Xu等[13]發現100fmol/L～100μmol/L BPA可明顯抑制小鼠顆粒細胞的增殖，且隨著BPA濃度增加，其抑制作用更加明顯。目前由于采用的檢測系統不同，在檢測BPA對卵泡發育的影響時出現了不同的結果，對BPA的影響濃度存在著很大的爭議。大多數研究是將卵泡膜細胞和顆粒細胞從卵泡上分離下來單獨進行培養，以研究BPA的影響。實際上卵泡是一個復雜的整體結構，各類細胞之間會發生相互作用，單獨分離出某類細胞以研究BPA的作用，其結果會因未考慮卵泡的整體結構而產生偏差。本實驗采用腔前卵泡的體外培養系統，對整個卵泡進行體外培養，研究BPA對整個卵泡發育過程的影響，保證了結果的準確性和可靠性，為研究環境毒性物質對生殖的干擾作用提供了一個很好的研究思路。

考慮到BPA具有類雌激素的作用，可能會影響卵泡對E2的分泌和雌激素受體的表達，本研究檢測了小鼠卵泡培養液中E2的分泌水平。結果發現45μmol/L BPA組D8和D10培養液中E2的分泌水平明顯降低，抑制了卵泡中雌激素的合成和分泌。Jackye等[14]也發現44～440μmol/L BPA可明顯抑制卵泡雌激素及孕激素的合成和分泌。雌激素是由顆粒細胞和膜細胞共同合成的，雌激素分泌水平下降表明顆粒細胞和膜細胞的激素合成功能受損，可能會影響卵泡中卵母細胞雌激素受體的表達。Yu等[2]在雞胚上發現BPA通過雌激素受體途徑干擾了原始卵泡的形成。同時本研究發現，BPA抑制了顆粒細胞增殖，降低了卵母細胞雌激素受體的表達，抑制了雌激素對卵母細胞的促發育作用，導致裸卵率明顯增加，成熟的M2期卵母細胞數量明顯減少。Campen等[15]也發現50μmol/L BPA明顯干擾了減數分裂紡錘體的形成和染色體的正常排列，進而影響了卵母細胞的成熟。

綜上所述，本實驗采用腔前卵泡的體外培養系統，保持了卵泡結構的完整性，研究了BPA對卵巢卵泡發育的干擾作用，發現45μmol/L BPA明顯干擾了卵泡發育，抑制了卵母細胞的成熟，結果準確可靠，為研究BPA對人類健康的影響濃度和影響作用提供了借鑒依據，同時為研究環境內毒性物質對女性生殖健康的影響提供了一個合理、可行的研究思路。