高效液相色譜法測定貉子肉中四環素類藥物殘留

李 曼，張珍珍，楊衛軍，曹秀梅

（河北省秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心，河北 秦皇島 066000）

四環素類藥物（TCs）是一類廣譜抗菌藥物，臨床上主要用于治療革蘭氏陽性、陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體和螺旋體等病原微生物引起的感染。此外，四環素還作為生長促進劑被用在動物生產中，曾以價格低、抗菌譜廣、飼料報酬高等優點而廣泛應用在畜牧養殖生產上。人食用四環素殘留超標的動物源食品后，藥物會在人體內慢慢蓄積，當藥物濃度達到一定量時，會造成人體急慢性中毒，嚴重影響人的身體健康[1]。目前，四環素類抗生素的主要檢測方法有高效液相色譜法、微生物法和分光光度法[2]，其中高效液相色譜法應用最為廣泛。采用高效液相色譜法測定雞肉、水產品、雞蛋、豬肉中四環素的方法已見相關報道[3-6]，而采用高效液相色譜法測定測定貉子肉中四環素類藥物殘留鮮有報道。

本文通過對GB/T 21317-2007《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》中高效液相色譜法的前處理方法進行改進[7]，以期建立更加快速準確地適用于貉子肉中四環素類藥物的殘留方法，對有效監控該藥在貉子的養殖中的應用、評價貉肉食用的安全性具有重要意義。

1材料與儀器

1.1 儀器島津LC-20A液相色譜儀配SPD-10A VP PLUS紫外檢測器；SB-5200DT超聲清洗機；3H20RI智能高速冷凍離心機；UVS-1漩渦振蕩器；TTL-Ⅱ氮吹儀；SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取濃縮裝置；FW100高速萬能粉粹機；CP214萬分之一天平。

1.2 試劑四環素、土霉素、金霉素、強力霉素標準品，純度均≥95%（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；檸檬酸（分析純，天津市風船化學試劑科學有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，天津市巴斯夫化工有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉、三氟乙酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；0.1 mol/L檸檬酸溶液；0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液；Mcllvaine緩沖溶液（pH=4±0.05）；0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液；甲醇+水（1+19）；甲醇+乙酸乙酯（1+9）；10 mmol/L三氟乙酸水溶液。

2 方法

2.1 標準溶液的配制儲備液：分別精密稱取土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度為100 mg/L，置于-18℃保存。

混合標準中間液：分別精密吸取標準儲備液各1 mL置于10 mL容量瓶中，用乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合標準中間溶液，土霉素、四環素、金霉素、強力霉素濃度均為10 mg/L。

混合標準工作液：精密吸取0.125、0.25、0.5、0.75、1.25 mL混合標準中間液，分別用流動相溶液稀釋定容至25 mL，即得系列混合標準工作液，土霉素、四環素、金霉素、強力霉素的濃度分別為50、100、200、300、500 μg/L。現用現配。

2.2 色譜分離條件 色譜柱：Incrtsil C8-5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：乙腈+10 mmol/L三氟乙酸水溶液=30+70；流速：1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.3 樣品的制備及處理

2.3.1 樣品的提取 稱取經搗碎勻漿的貉子肉樣品5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，分別用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，3 000 r/min離心5 min（溫度低于15℃），合并上清液，并定容至25 mL，混勻，5 000 r/min離心10 min（溫度低于15℃），用快速濾紙過濾，待凈化。

2.3.2 樣品的凈化準確吸取5 mL提取液以1滴/s的速度過HLB固相萃取住（使用前分別用5 mL甲醇和5 mL水預處理），待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水淋洗，棄去全部流出液，2.0 KPa以下減壓抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脫，將洗脫液吹氮濃縮至干（溫度低于40℃），用1.0 mL流動相溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，待測定。

2.4 標準曲線的繪制配制系列濃度混合標準工作液,得到土霉素、四環素、金霉素、強力霉素的濃度分別為50、100、200、300、500 μg/L，在上述色譜條件下測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，作校正曲線，得線性回歸方程。

3 結果與分析

3.1 標準曲線及線性范圍將系列標準工作溶液，依次從低濃度到高濃度進行分析，按峰面積與對應的對照溶液的濃度做標準曲線。其濃度在50～500 μg/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程及相關系數見表1。

3.2 方法檢出限按照上述2.3方法進行樣品處理，標準品和樣品依次在3.750 min（土霉素）、4.420 mi（n四環素）、6.953 min（金霉素）、7.848 min（強力霉素）出峰，空白試料對所測分析物無干擾，在該色譜條件下土霉素、四環素、金霉素、強力霉素均得到很好的分離。根據樣品進行標準物質添加回收率試驗，以3倍信噪比可測得的最低質量濃度確定方法的檢出限，土霉素為47.5 μg/kg、四環素為48.2μg/kg、金霉素為48.9 μg/kg、強力霉素為49.6 μg/kg；四環素類藥物標準溶液色譜圖見圖1，空白組織的色譜圖及空白組織中添加100 μg/kg四環素類藥物的色譜圖，見圖2和圖3。

表1 四環素類藥物線性方程及相關系數Table 1Linear equations and correlation coefficients of tetracyclines

圖1 四環素類藥物標準溶液色譜圖（50 μg/L）Fig.1Chromatogram of standard for tetracyclines

3.3 準確度和精密度采用標準添加法，在空白組織中添加3個不同濃度（50、100和200 μg/kg）的四環素類標準溶液進行回收率測定，每個濃度設定6個平行樣品，同時進行空白試驗，重復3次，四種藥物回收率達到80.3%～97.4%，相對標準偏差（RSD）為1.9%～5.5%，結果見表2。準確吸取標準品溶液20 μL，重復進樣11次，在相同色譜條件下對峰面積進行分析，結果表明，峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.31%，表明儀器精密度良好。

3.4 與 G B/ T 21317-2007方法比較

3.4.1 采用GB/T 21317-2007《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法——液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》方法中流動相：乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）時，結果見圖4，由圖4可見，陽性添加樣品中四環素峰出現肩峰，峰分離度不佳。

3.4.2 采用GB/T 21317-2007《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法——液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》方法，回收率結果見表3，結果顯示采用國標法對樣品進行前處理，4種四環素類藥物的添加回收率在70.2%～75.2%之間。

圖2 空白樣品色譜圖Fig.2Chromatogram of blank sample

圖3 加標樣品色譜圖（100 μg/kg）Fig.3 Chromatogram of positive sample

圖4 加標樣品色譜圖（流動相：乙腈+三氟乙酸水溶液35+65）Fig.4 Chromatogram of positive sample

4 討論

4.1 流動相比例的調整經比較，流動相乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）與乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70），后者作為流動相對目標峰的響應最靈敏、分離度好、出峰時間短，而且檢測系統壓力最低，考慮到在不影響分離度的前提下，最終選定乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）作為流動相，分離效果最理想。

表2 貉子肉中四環素類藥物添加回收率試驗結果Table 2Result of recovery test for tetracyclines in nyctereutes procyonoides tissues

表3 國標法測定貉子肉中四環素類藥物添加回收率試驗結果Table 3Result of national standard method for tretracyclines recovery rate in nyctereutes procyonoides tissues

4.2 樣品提取過程的簡化本文將GB/T 21317-2007《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》中樣品前處理方法進行改進，在試樣的提取過程中，分別用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，離心過濾后凈化。該方法與GB/T 21317-2007進行比較，結果顯示，采用國標法測定貉子肉中四環素類藥物添加回收率試驗中，土霉素添加回收率為70.2%～75.2%，四環素添加回收率70.2%～74.2%，金霉素添加回收率70.5%～73.7%，強力霉素添加回收率70.6%～74.8%；而采用改進后的樣品前處理方法時，土霉素添加回收率為80.3%～97.4%，四環素添加回收率81.8%～96.8%，金霉素添加回收率80.4%～96.6%，強力霉素添加回收率80.7%～93.3%。從試驗可以看出，采用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次之后，貉子肉中四環素類藥物的溶出量已趨于穩定，因此，按照前處理步驟越少越好、操作越簡單越好、耗時耗材越少越佳的原則，選擇該方法為最佳樣品前處理方法。該方法簡化了樣品前處理步驟，且檢測結果準確可靠，適用于高效液相色譜法測定貉子肉中四環素類藥物殘留。