豬Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP多態(tài)性分析

付保強，彭 帥，顧亞榮，趙 倩，杜 倩，穆曉峰

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

編碼豬天然抗性相關(guān)巨噬蛋白的基因（Natural resistance associated macrophage protein，Nramp1）是一個相對保守的基因，主要定位于第15號染色體長臂端，包含15個外顯子和14個內(nèi)含子，編碼氨基酸數(shù)539[1-3]，表達于網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞器官的巨噬細胞中，如豬的脾臟、大腦、肺臟的免疫器官，用于抵抗外來病原微生物的作用[4]。其作用機制為存在于巨噬細胞中的內(nèi)吞小體通過消耗含有病原微生物吞噬體中的Fe2+和Mn2+等二價金屬離子，使病原微生物缺乏合成的酶系從而使動物免受細菌等病原體的侵害[5]。由于豬Nramp1基因具有良好的特異性，因此可作為研究豬免疫疾病的候選基因之一。

前人已對豬Nramp1基因內(nèi)含子6做了大量研究，楊軍等[6]采用PCR-RFLP方法對3個外種豬群Nramp1基因第6內(nèi)含子序列多態(tài)性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各基因型純合度較低，具有中度遺傳多態(tài)性。李娟娟等[7]通過利用PCR-SSCP方法檢測了135頭合作豬Nramp1基因第六內(nèi)含子的多態(tài)性，共檢測到5種基因型，序列比對發(fā)現(xiàn)10個新的核苷酸多態(tài)位點。周文兵等[8]以浦東白豬為研究對象，通過PCR技術(shù)分離和克隆Nramp1基因的第6內(nèi)含子基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該段基因中有3個突變點。前人研究中對Nramp1基因的多態(tài)性均采用傳統(tǒng)的PCR-RFLP或SSCP的方法進行分析，本研究以大白豬、長白豬和杜洛克豬為

研究對象，采用一種較為快速的方法，即混合DNA擴增產(chǎn)物直接測序法，對Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP（單核苷酸多態(tài)性）進行篩選，為該基因遺傳變異的深入研究和豬的抗病分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本研究的試驗材料采自甘肅臨澤新華豬場的139頭大白豬、126頭長白豬和115頭杜洛克豬的耳組織樣品，于仔豬出生1周內(nèi)取樣各約2 g，將其放置于75%酒精中，20℃保存，帶回實驗室后，利用試劑盒提取豬耳組織基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度。

1.2 引物設(shè)計本試驗引物引用于文獻報道[9]，對Nramp1基因內(nèi)含子6的部分序列進行擴增，引物序列 為 F： 5'-GCCAGCTTCCACAGTCTCCAG-3'； R：5'-GGGGGTACAAAGGGGAAGAAG-3'，預(yù)期擴增片段長度為483 bp，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 D N A混合池構(gòu)建及 P C R擴增各豬種隨機抽取30個效果良好的樣品，各取1 μL效構(gòu)建DNA混合池。擴增體系20 μL，DNA模板0.8 μL。上、下游引物各 0.4 μL，2.PowerTaqPCR MasterMix 11st，ddH2O 7.4 μL。PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行PCR測序于進一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析通過Editseq軟件進行測序峰圖和序列對比分析，篩選豬Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP位點。各豬種測序峰圖中各SNP位點的峰高利用軟件MWSnap中標尺測量工具進行測量，并利用以下公式進行等位基因頻率的估算：

注：fs表示SNP位點中s等位基因的頻率（s=a/b），hm和hn分別表示測序峰圖上該SNP位點等位基因m和n的峰高。

2 結(jié)果與分析

2.1 P C R擴增結(jié)果通過1%的瓊脂糖凝膠對豬Nramp1基因內(nèi)含子6進行PCR擴增產(chǎn)物檢測，擴增產(chǎn)物片段大小在500 bp左右，條帶清晰、無雜帶、特異性良好且與目的片段長度相符（圖1）。

圖1 大白豬、長白豬、杜洛克豬Nramp1基因內(nèi)含子6 PCR電泳結(jié)果圖Fig.1The results of the PCR amplicons of the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

2.2 測序結(jié)果分析三豬種Nramp1基因內(nèi)含子6測序峰圖如圖2所示，大白豬、長白豬、杜洛克豬在Nramp1基因內(nèi)含子6上均有4個SNP位點（C111A、C225T、G296T和T297G）。

2.3 S N P等位基因頻率估算利用MWSnap軟件對3個品種豬測序結(jié)果SNP位點套峰的峰高進行了測量，利用公式計算出各等位基因頻率，結(jié)果見表1。三豬種在C111A、C225T、G296T和T297G位點上均存在優(yōu)勢等位基因，分別為111位的C等位基因、225位的C等位基因、296位的G等位基因以及297位的T等位基因。

3 討論

圖2 大白豬、長白豬、杜洛克豬Nramp1基因內(nèi)含子6擴增產(chǎn)物測序峰圖及SNP位點Fig.2 Sequenceing peak of PCR products and SNP sites of the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

表1 大白豬、長白豬、杜洛克豬Nramp1基因內(nèi)含子6 SNP位點各等位基因頻率估算結(jié)果Table 1 The estimation result of allele frequency of every SNP sites about the Nramp1 intron 6 in Large White pigs,Landrace pigs and Duroc pigs

動物疾病的發(fā)生與傳染受到多種因素影響，包括外界因素和自身等因素，豬腹瀉是影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疾病之一。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因（Nramp）對豬的疾病控制起著重要的作用。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是從基因水平對突變位點進行研究和分析，對于研究基因功能和指導疾病控制具有重要作用。吳秋菊等[10]通過酶切技術(shù)對3個品種豬Nramp1內(nèi)含子6多態(tài)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個品種中基因型頻率和基因頻率分布趨近一致。吳宏梅等[11]對大白豬和松遼黑豬Nramp1基因第6內(nèi)含子多態(tài)性與豬免疫抗病的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種豬Nramp1基因型與免疫功能間存在著顯著相關(guān)，提示Nramp1基因可作為抗病力性狀篩選的主要候選基因之一。羅興等[12]通過對大白豬Nramp1基因的單核苷酸多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因不同基因型對大白仔豬斷奶前腹瀉有顯著影響，提示Nramp1基因內(nèi)含子6可以作為大白仔豬斷奶前抗腹瀉育種分子標記。古少波等[13]研究發(fā)現(xiàn)豬Nramp1基因內(nèi)含子6的多態(tài)性與仔豬腹瀉具有一定的相關(guān)性。這些結(jié)果都表明豬Nramp1基因內(nèi)含子6與豬疾病相關(guān)，但均未對其具體的SNP進行分析。本研究利用DNA混合池直接測序的方法對3種豬Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP多態(tài)性進行分析，共篩選出4個SNP位點，這些位點的多態(tài)性有可能在豬疾病發(fā)生過程中起到一定的作用。本研究結(jié)果可作為篩選豬疾病遺傳標記的理論依據(jù)，并在分子遺傳和育種水平上為選育抗病能力強的豬種提供理論參考。