霍山石斛內生真菌抗病原真菌研究

岳婧怡

(蕪湖職業技術學院生物工程學院，安徽 蕪湖 241000)

郁陽

(安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

湯強，童傳旺，徐迪，王巨龍

(蕪湖職業技術學院生物工程學院，安徽 蕪湖 241000)

內生真菌長期生活在植物體內的特殊環境中，植物以其內真生菌的組織、細胞及其代謝產物為內環境，而內生真菌以宿主植物的組織和細胞及其代謝產物為外環境，兩者之間互相進行物質、能量及基因交流，在長期進化過程中與寄主協同進化，在演化過程中兩者形成了互惠共生關系。這種關系決定了內生真菌對宿主植物具有促生抗逆(抗干旱、抗病蟲害等)以及有效成分合成積累的獨特生物學特性。目前，已有學者[1～4]從藥用植物內生真菌中，篩選分離出大量具有較強抗農作物病害活性的內生真菌及其代謝產物。從藥用植物內生真菌中尋找和發現抗病原真菌有效活性成分，為新型生物農藥的研究和開發提供了新的途徑。

石斛屬常見病害主要有黑斑病、炭疽病、霜霉病、灰霉病、白絹病[5,6]。其中炭疽病主要病原為膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，主要為害石斛葉片，也為害莖部，幼苗、成株均可得病；黑斑病病原菌為交鏈孢真菌細極鏈格孢菌Alternariatenuissima，主要為害石斛葉；根腐病主要病原菌為立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，主要為害石斛根部，導致根充水腐爛。目前對栽培石斛病害的防治主要依靠化學農藥，這必然導致產品中農藥殘留檢出甚至超標，危害藥材品質。本研究通過前期對霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)內生真菌進行分離鑒定，分離得到6種內生真菌(Alternariaeichhorniae、Colletotrichumorchidophilum、Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Aspergillusflavus)，并對其進行抗病原真菌活性篩選，篩選得到活性較好的2株內生真菌，為后期尋找抗病原真菌(尤其對宿主植物致病真菌)活性先導化合物，揭示內生真菌與宿主植物活性成分之間的關系以及探索新穎的活性化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與試劑

JJ-CJ-2FD 潔凈工作臺：吳江市凈化設備總廠；MIKRO 22R 高速冷凍離心機：德國Hettick 公司；SHP-250 型生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠； DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；所用試劑均為分析純。

1.1.2培養基

內生真菌分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)不含抗生素；內生真菌發酵采用馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(potato dextrose broth，PDB)。

1.1.3供試菌

霍山石斛內生真菌：Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Stagonosporopsisoculihominis、Alternariaeichhorniae、Aspergillusflavus、Colletotrichumorchidophilum。菌種保存于蕪湖職業技術學院生物工程學院。

植物病原真菌：小麥紋枯菌(Rhizotoniacerealis)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)、煙草蛇眼(Cercosporanicotianae)、茄子莖枯菌(Corynesporamelongnae)、玉米圓斑菌(Bipolariscarbonum)、牡丹炭疽菌(Colletotrichumsp.)、茄子棉疫(Phytophthoraparasitica)。7 種植物病原真菌由安徽中醫藥大學天然藥物化學教研室提供。

石斛病原真菌：立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniCFCC)、極細交鏈孢菌(AlternariatenuissimaCFCC)、膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesCFCC)。3種病原真菌由中國林業微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 方法

1.2.1供試菌發酵液制備

將保存在斜面試管的6種供試菌在無菌環境下接種于PDA 培養基中，置于恒溫培養箱中28℃避光培養5～7d，用打孔器取直徑為6mm 的菌餅接種于盛有200mLPDB 液體培養基的500mL錐形瓶中，置于28℃搖床(180r/min)培養5～7d 后，減壓過濾，得濾液，即為6種供試菌的發酵液。取發酵液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，得到6種供試菌發酵液乙酸乙酯萃取物。取一定量萃取物浸膏置容量瓶中，加入微量的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，無菌水定容，配制成1mg/mL 濃度藥液。

1.2.2抑菌試驗

采用菌落生長速率法進行。取1mL 供試藥液，實驗前用0.22μm 微孔濾頭濾過，與9mL的PDA 培養基于無菌試管中混勻，倒入無菌培養皿中制成含藥培養基平板，以DMSO 和無菌水作空白對照。將病原真菌菌種接種于PDA 培養基平板上活化5～7d 后，用無菌打孔器在活化完全的病原真菌菌落邊緣打下6mm 生長一致的菌餅。將打好的菌餅菌絲面向下，接于培養基平板中心，封口，置于28℃恒溫培養箱培養5～10d。每個試驗平行重復3次。

抑菌結果采用十字交叉法[7]判定。待空白對照菌落長至平板邊緣時，即可測量各培養皿中菌落直徑，以3 次重復菌落直徑的平均值計算菌絲生長抑制率I。

I=[(C-T)/(C-6)]×100%。

式中：C為空白對照菌落生長直徑，mm；T為處理菌落生長直徑，mm；6為菌餅直徑，mm。

2 結果與分析

由表1可知，菌種Aspergillusflavus乙酸乙酯萃取液對10種病原真菌抑菌效果最差，Colletotrichumorchidophilum僅比Aspergillusflavus抑菌活性好，其他4種菌種乙酸乙酯萃取液對10種病原菌效果各有優劣，其中菌種Stagonosporopsisoculihominis對10種病原真菌平均抑菌率達到50%以上，尤其是對油菜菌核抑菌率高達90%；Alternariaeichhorniae相比其他菌種對3種石斛致病菌都有一定的抑菌率，且高于其他病原真菌抑菌率；Fusariumlactis對立枯絲核病原真菌抑菌率達到了100%；Phyllostictaaristolochiicola對10種病原真菌都具有一定的抑制作用。

表1 6種內生真菌對10種植物病原真菌體外抑制率

注：“-”表示染菌嚴重導致無法測得實驗數據。

就3種霍山石斛致病菌來說，Alternariaeichhorniae和Colletotrichumorchidophilum對其有廣譜抑菌效果，而Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis和Phyllostictaaristolochiicola對其中立枯絲核菌抑菌率都高達70%以上，尤其是Fusariumlactis對其抑菌率為100%。

3 討論

內生真菌是一類應用前景廣闊的微生物資源，在探討藥用植物內生真菌多樣性的同時，往往能從所分離得到的內生真菌中篩選出與宿主植物相似活性(抗菌抗氧化等)或者促生抗逆活性較好的菌株[8～10]。本研究選取了霍山石斛內生真菌，對其發酵液進行抗病原真菌活性試驗研究，綜合篩選出2株廣譜和選擇性抗病原真菌較好的菌株，這為今后尋找抗病原真菌活性分子以及生物型農藥的開發提供參考。