基質小泡在糖尿病足截肢患者脛前動脈斑塊內 鈣化中的作用分析

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(江蘇大學附屬醫院心內科，江蘇 鎮江 212001)

我國糖尿病患病率急劇增加，已成為全球糖尿病人數最多的國家。糖尿病嚴重危害人類健康[1-2]，同時為國家和個人帶來了巨大的經濟負擔。動脈粥樣硬化斑塊內鈣化是糖尿病的晚期并發癥[3]，是動脈粥樣硬化疾病進程中常見的不良事件，是心腦血管疾病致死致殘的重要預測因子[4]。因此研究斑塊內鈣化的發生機制對糖尿病心血管并發癥的防治具有重要的理論價值及社會意義。已有的研究表明，基質小泡(matrix vesicles，MV)是血管鈣化的起始位點[5]。MV通過膜聯蛋白及磷離子通道富集鈣磷離子，形成最初的羥基磷灰石結晶[6]。此后羥基磷灰石結晶作為鈣鹽結晶核心，繼續生長形成鈣化結節。但是在糖尿病斑塊內鈣化患者中，MV與斑塊內鈣鹽沉積的相關性如何，MV水平能否預測糖尿病患者的鈣化程度，現有的研究尚不能給出明確的答案。因此，本研究通過糖尿病足截肢患者脛前動脈標本的采集及分子生物學檢測，探討MV在斑塊內鈣化中的作用，為糖尿病患者斑塊內鈣化的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1研究對象選取2015 年10月～2018 年1月在江蘇大學附屬醫院行糖尿病足截肢手術的患者共40例。根據組織鈣定量測定脛前動脈鈣化程度將患者分為低鈣化組(鈣定量<4 mol/mg，n=20)及高鈣化組(鈣定量>4 mol/mg，n=20)。所有手術均經江蘇大學附屬醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書及手術同意書，醫務科備案。

1.2組織鈣定量測定使用0.6 mol/L HCl溶液對烘干的動脈組織(約10 mg)進行脫鈣24 h，收集上清液，使用鄰甲酚酞法測量鈣含量。

1.3 Vonkossa染色取脛前動脈石蠟切片，脫蠟脫水后按試劑盒操作說明置于2% 硝酸銀溶液中，強陽光線下直射40 min 后用蒸餾水沖洗3 遍，吸凈蒸餾水后用5% 硫代硫酸鈉溶液定影處理2 min，再次用蒸餾水沖洗3 min，中性品紅復染3 min，經脫水、透明、封片后，于光鏡下觀察主動脈鈣鹽沉積情況。

1.4 MV的提取將組織從-80 ℃液氮中取出，裂解液充分裂解后放入無菌研磨器中冰上充分研磨，并靜置1 h。將混合液300 g室溫下離心5 min后20 000 g 4 ℃離心30 min去除組織碎片。收集上清液，并于超速離心機中100 000 g 4 ℃下離心60 min，PBS緩沖液洗滌沉淀物后同樣條件下再次離心60 min。MV沉淀用PBS緩沖液稀釋后放于-20 ℃保存。

1.5納米粒子跟蹤分析(NTA) 使用Zetaview(Particle Metrix)進行MV濃度粒徑測試。其方法即納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)，原理是對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，結合Stockes-Einstein方程式計算出納米顆粒的流體力學直徑和濃度。測量每個組的20個獨立樣本，然后顯示它們的平均值。

1.6掃描電鏡在獲得樣品的顯微照片之前，使用臨界點干燥器(PVT-3，Tousimis Semidri Rockville，MD，USA)從樣品中完全蒸發水。然后在真空下用10 nm金層涂覆樣品，并用SEM(SU8000和S4800，Hitachi，Tokyo，Japan)檢查。

1.7 Western blot檢測提取MV總蛋白，BCA 蛋白定量并煮沸變性，8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離后，電轉移(100 mA 2h) 至PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶4 ℃搖床1 h后，用CD9抗體進行免疫印跡。按1∶5 000比例加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1.5 h后，用Western blot 熒光檢測試劑激發熒光，蛋白條帶采用UVP凝膠圖像分析系統分析，以各組目的蛋白與內參蛋白吸光度值的比值來比較待測蛋白的表達差異。

1.8統計學分析所有數據均采用 SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料中正態分布用均數±標準差；非正態分布中位數±四分位數間距。兩組間比較用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用率或百分比，組間比較用χ2檢驗。相關分析采用Pearson相關性分析，MV預測鈣化的敏感性與特異性采用受試者工作曲線(Receiver Operating Characteristic，ROC)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1糖尿病足截肢患者的基線資料低鈣化組和高鈣化組糖尿病足截肢患者在男女性別比例、平均年齡、吸煙史、身體質量指數(body mass index, BMI)、高血壓比例、總膽固醇、空腹血糖(糖尿病患者強化胰島素治療后)、低密度脂蛋白(LDLC)及高密度脂蛋白(HDLC)等方面比較，差異無顯著性，而糖尿病病程存在顯著性差異。顯示糖尿病足截肢患者脛前動脈鈣化程度可能隨患者糖尿病病程的增加而加重(表1)。

表1 兩組糖尿病足截肢患者的基線資料分析 (n=20)

2.2糖尿病足截肢患者脛前動脈鈣化情況Vonkossa染色結果顯示兩組截肢患者脛前動脈內均可見大量的動脈粥樣硬化斑塊，黑染的鈣化灶多分布在斑塊內壞死核心灶周圍，尤其是斑塊靠近中膜的部位；且高鈣化組較低鈣化組的鈣化程度更重(圖1)。

圖1 兩組糖尿病足截肢患者脛前動脈鈣化情況 Vonkossa染色顯示脛前動脈斑塊內鈣鹽沉積， 紅色箭頭所指棕黑色顆粒為鈣沉積區.A：低鈣化組；B：高鈣化組

2.3糖尿病足截肢患者掃描電鏡下MVs特征掃描電子顯微鏡(SEM)結果顯示，低鈣化組(圖2A)中MV數量較少，而高鈣化組(圖2B)的MV數量多，且多呈富集狀態。

圖2 糖尿病足截肢患者掃描電鏡下MVs特征 檢測脛前動脈斑塊內MV， 圖中紅色箭頭所指區域為MV富集區.A：低鈣化組；B：高鈣化組

2.4糖尿病足截肢患者MVs標記蛋白CD9表達水平Western blot結果顯示兩組提取物均表達MV標記蛋白CD9，提示成功提取MV。并且相對吸光度值半定量分析顯示高鈣化組脛前動脈斑塊內CD9的表達量顯著高于低鈣化組，約高出2.62倍 (0.803±0.075vs0.307±0.122，P<0.01)。結合前述結果可推測，脛前動脈斑塊內的鈣化程度與MV的量有一定關聯。見圖3。

圖3 糖尿病足截肢患者MVs標記蛋白CD9的表達A：Western blot檢測低鈣化組和高鈣化組MV中CD9的表達量；B：相對吸光度值半定量分析與低鈣化組比較，▲P<0.01

2.5糖尿病足截肢患者MVs水平與脛前動脈鈣定量的相關性鈣定量測定顯示高鈣化組脛前動脈斑塊內鈣含量是低鈣化組的2.39倍(6.47±2.24 mol/mgvs2.71±0.96 mol/mg，表2)。Pearson相關性分析顯示，MV水平與脛前動脈鈣含量成正相關(r=0.772 9，P<0.01；圖4)。

表2 糖尿病足截肢患者脛前動脈鈣定量 及MVs水平(n=20)

圖4 MV水平與脛前動脈鈣含量的相關性分析

2.6糖尿病足截肢患者MVs對脛前動脈斑塊內鈣化的預測價值ROC曲線顯示曲線下面積為0.894(95% CI：0.788～0.999，P<0.01)。MVs為41×106particles /mL時預測鈣化的敏感性為85%，特異性為85%，約登指數最大為0.7。見圖5。

圖5 糖尿病足截肢患者MV對脛前動脈斑塊內 鈣化的預測價值

3 討論

糖尿病動脈粥樣硬化的臨床終點事件包括不穩定或穩定的心絞痛、血栓形成、心臟病發作、中風和冠狀動脈猝死，斑塊內鈣化的存在與上述臨床事件的發生密切相關[7]。冠心病的發病率已經在不斷的上升,發病人群也逐漸從老年人群轉向中青年人群[8]。已有研究證實粥樣硬化斑塊內鈣化是心血管事件的危險標志[7]，因此研究動脈粥樣硬化斑塊內鈣化對動脈粥樣硬化疾病的預防和治療有重要的意義。

斑塊內鈣化與骨發育過程類似，是一個細胞介導的高度調控并可逆轉的主動過程[9-10]，是動脈粥樣硬化疾病進程中常見的不良事件，是心腦血管疾病致死致殘的重要預測因子[11]。斑塊內鈣化是由于高鈣磷環境以及局部或全身礦化誘導子上調、抑制子下調所導致的骨特異性羥基磷灰石結晶主動沉積在血管壁的病理過程[12]。在這一過程中, 血管壁礦化防御機制被耗竭, 平滑肌細胞等間葉細胞丟失原有表型而獲得成骨表型, 釋放礦化脂質小泡。脂質小泡(至少包括MV和凋亡小體兩種形式)為鈣化結晶提供了合適的成核微環境, 而血管壁彈性蛋白則為羥基磷灰石沉積提供了支架結構[13]。凋亡過程中從巨噬細胞和血管平滑肌細胞釋放的MV在形成鈣化過程中起關鍵作用。因此在成骨細胞樣細胞介導的鈣沉積與破骨細胞樣細胞介導的鈣吸收之間的平衡被打破后，血管壁內膜、中膜或主動脈瓣膜就可能形成異位鈣化[13-14]。本研究選取糖尿病足截肢患者脛前動脈標本，通過鈣定量檢測分組后進行鈣化染色，直觀顯示了兩組標本的鈣化程度。基線資料顯示鈣化程度可能與糖尿病病程有一定相關性。

MV是一種位于胞外，直徑50～200 nm的膜鑲嵌微顆粒。它是來自細胞的膜性結構，起源于礦物形成細胞(軟骨細胞、成骨細胞和牙質細胞)的質膜，選擇性分布于軟骨、骨等初始礦化位點[12,15]。MV被發現幾乎存在于所有正常的礦化或鈣化過程中，包括骨、軟骨、肌腱的鈣化。已有研究證實，血管平滑肌細胞、巨噬細胞等釋放的MV，是無定型磷酸鈣結晶成核的起始位點[16]。當堿性磷酸酶調控的磷酸鹽濃度達到足夠成核濃度時，MV靠近膜的內表面內羥基磷灰石結晶形成并沉積于成骨膠原纖維中，通過釋放到細胞外基質并與細胞外基質蛋白的相互作用啟動礦化過程，隨后繼續生長形成鈣化結節[16-18]。

已有的研究從不同側面闡述了糖尿病動脈粥樣硬化斑塊內鈣化的成因及發展[19]，但在糖尿病斑塊內鈣化的患者中，MV與斑塊內鈣化的相關性如何，以及MV水平能否預測糖尿病患者的鈣化程度，現有的研究尚不能給出明確的答案。本研究提取糖尿病足截肢患者脛前動脈內MV，并以NTA法檢測MV水平[20]，Pearson相關性分析顯示，MV水平與脛前動脈鈣定量正相關(r=0.7729，P<0.01)，ROC曲線顯示曲線下面積為0.894，提示MV水平用于預測脛前動脈斑塊內鈣化是有一定可靠性的。

本研究尚存在一定局限性。首先，本研究屬于觀察性研究，不能確定MV水平與斑塊內鈣化的因果關系，后期還將從動物水平及細胞水平做進一步的研究。其此，MV的形態與MV內成分對斑塊內鈣化的形成也有一定影響，本研究由于條件限制未將上述因素納入分析，后續實驗將從以上方面進行深入研究。總之，MV水平與糖尿病動脈斑塊內鈣化的演進存在正相關,其水平對不同程度斑塊內鈣化有一定的預測價值，這一結果可能為靶向發病機制的鈣化防治策略研究帶來新的切入點。