骨髓間充質干細胞移植對腦動脈栓塞大鼠VEGF165、 Notch1表達的影響

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(池州市人民醫院神經外科，安徽 池州 247000)

動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)是指栓子沿血液循環進入腦動脈系統，引起動脈管腔閉塞，致使該動脈供血區局部腦組織的壞死。MCAO是威脅人類健康的一種疾病，近年來發現促進腦內血管生成是一種新的恢復腦梗死的治療手段。骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是具有自我更新能力的一種細胞，可以多向分化為機體的各種細胞，其在體外誘導可以分化為神經細胞[1]，在組織工程、基因工程、細胞移植方面有較好的臨床應用前景，BMSCs移植是治療腦血管疾病一種新的治療方法。本實驗通過建立大鼠腦動脈栓塞模型，觀察BMSCs移植后腦組織微血管密度(micro-vascular density，MVD)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)165、Notch1的表達，來探究BMSCs促進血管新生的機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑實驗動物：45只健康雄性SD大鼠，體質量(260±20)g；10只健康雄性SD大鼠，體質量(90±10)g，購自北京維通利華實驗技術有限公司，許可證號SCXK(京)2011-0011。

主要試劑：胎牛血清、DMEM培養基、胰酶、雙抗(Gibico，美國)；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(Preprotech，美國)；小鼠抗大鼠Notch1抗體(Chemicon，美國)；兔抗大鼠VEGF抗體(Preprotech，美國)；辣根過氧化物標記的羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；組織蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)。主要儀器：光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)；低溫高速離心機(Thermo，美國)；PCR儀(ABI，美國)；微量移液器、培養瓶、培養皿等。

1.2 BMSCs的分離培養[2]取體重為(90±10)g SD大鼠，分離其兩側的股骨，以使骨髓腔充分暴露，用DMEM培養基反復沖洗后，將骨髓懸液過濾并離心，棄掉上清，將重懸的細胞移至培養瓶中于細胞培養箱中進行培養。培養24 h后棄掉沒有貼壁的細胞，更換新的培養液。在此之后每3天進行1次換液，等到細胞生長融合達到80%～90%時傳代培養。取第4代的細胞用于本實驗研究來進行移植。

1.3 MCAO模型的建立線栓法制作MCAO模型[3-4]。將大鼠按照1 mL/100 g腹腔注射4%的水合氯醛麻醉。大鼠固定后，在頸部正中切口，分離暴露出右側頸總、頸內和頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端、頸總動脈近心端，夾閉頸內動脈，在頸外動脈近心端剪一“V”形切口，將線栓插入距離頸總動脈18 mm處時固定，縫合皮下組織，1個小時后拔線，縫合切口。大鼠即刻出現右側Horner征即為模型成功。

1.4 MCAO癱瘓程度評分動物麻醉清醒后，參照Zea Longa方法[3]，對神經功能缺損進行評分。1～3分者為納入本實驗研究對象，對于神經損傷太重(4分)或太輕(0分)的老鼠棄之不用。

1.5實驗分組BMSCs移植組：模型制作成功24小時后，將第4代的BMSCs細胞3×106個混懸于0.6 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，通過股靜脈勻速注入。MACO組，24小時后股靜脈勻速注入等量PBS。假手術對照組，只切開頸部皮膚暴露動脈，不插線栓，24小時后股靜脈勻速注入等量PBS。各組再按不同時間點隨機分為3組，每組5只。BMSCs移植后4天、7天、14天取材。

1.6 MVD檢測隨機選擇各組各時間點腦組織冰凍切片5張，按照免疫熒光染色法Ⅷ因子檢測法，每單個內皮細胞或內皮簇為一個血管計數，每個標本取2～3張切片，熒光顯微鏡下對微血管進行計數。用均值來作為微血管密度。

1.7 Western blot檢測VEGF165、Notch1蛋白表達

嚴格按照試劑盒說明書進行操作來提取各組大鼠腦組織中的總蛋白，并進行蛋白定量。分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后行蛋白電泳、電轉移，5%脫脂奶粉封閉后，加入相應一抗兔抗大鼠VEGF抗體、小鼠抗大鼠Notch1抗體(稀釋倍數為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜、洗膜后加入二抗(稀釋倍數為1∶2 000)37 ℃孵育2 h，清洗后于暗室中滴加化學發光液顯影，于凝膠成像系統采集圖像。以β-actin蛋白作為內參，各組目的條帶灰度值與內參進行比值為蛋白的表達相對量。

1.8 RT-PCR檢測VEGF165、Notch1 mRNA表達取大鼠腦組織提取總RNA，于PCR儀中行逆轉錄，按照預先設定熒光定量PCR反應程序進行擴增，行瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像分析系統對電泳條帶的吸光度(OD值)半定量分析。結果以目的基因的OD值比上β-actin的OD值來表示。

2 結果

2.1 BMSCs形態學變化原代培養的細胞呈圓形，1天后即開始貼壁生長，3天后可見細胞呈成纖維樣，5天時細胞生長增加，10天左右細胞生長達到80%～90%融合，細胞呈長梭形。傳代后，細胞增殖速度加快，隨著傳代代數的增加，細胞形態多逐漸趨于一致較均一為長梭形，并呈漩渦或束狀排列生長(圖1)。

圖1 骨髓間充質干細胞的形態學觀察(200×)A：原代培養的細胞；B：呈成纖維樣生長的貼壁干細胞； C：細胞生長達到80%～90%；D：第4代干細胞

2.2各個不同時間點大鼠腦組織MVD分析在假手術組微血管計數幾乎很少，MCAO組、BMSCs組微血管數量顯著高于假手術組(P<0.05)，BMSCs移植后新生血管數量明顯增多(P<0.05，表1)。

表1 大鼠腦組織不同時間微血管計數

與假手術對照組，aP<0.05；與MCAO組，bP<0.05

2.3 Wsternblot檢測VEGF165、Notch1蛋白的表達MCAO組、BMSCs組在各個時間點VEGF165、Notch1蛋白表達均明顯高于假手術對照組(P<0.05)，BMSCs移植后，表達更高(P<0.05)，在第14天各組蛋白表達開始下降(圖2、表2)。

圖2 各組大鼠不同時間點VEGF165、Notch1蛋白的表達

分組VEGF1654天7天14天Notch14天7天14天假手術對照組0.019±0.0020.019±0.0030.018±0.0030.014±0.0020.014±0.0040.016±0.003MCAO組0.156±0.007a0.189±0.011a0.121±0.007a0.145±0.008a0.186±0.010a0.130±0.007aBMSCs組0.214±0.013ab0.298±0.014ab0.175±0.006ab0.202±0.012ab0.345±0.014ab0.183±0.008ab

與假手術對照組，aP<0.05；與MCAO組，bP<0.05

2.4 RT-PCR檢測VEGF165、Notch1 mRNA的表達

MCAO組、BMSCs組VEGF165、Notch1 mRNA表達均明顯高于假手術對照組(P<0.05)，BMSCs移植后表達更高(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠不同時間點腦組織VEGF165、Notch1 mRNA的表達(n=5)

與假手術對照組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05

3 討論

腦栓塞有較高的發病率及致死率，會導致神經功能損害，隨著對干細胞移植這一領域的研究越來越多，為治療腦動脈栓塞提供了新的治療手段。BMSCs來源充足，生物特性穩定，易于傳代培養，可以分泌大量促血管生長因子[5]。BMSCs移植可以通過組織滲透、減少細胞凋亡、分泌細胞因子、減少炎癥反應等許多途徑而作用于神經系統，對受損組織發揮修復與保護的作用[6]。BMSCs具有多向分化的功能，有研究表明BMSCs移植可以遷移到病變部位，分化為神經細胞，改善腦梗死模型大鼠的神經功能[7]。BMSCs移植對腦缺血損傷具有恢復、保護作用，其作用機理可能是通過增加神經細胞數量與神經因子表達來實現[8]。

血管新生是指血管內皮細胞在血管生成因子的作用下形成新生血管，血管發生密度改變決定了腦梗死后神經元存活與否，同時也是干細胞移植成功與否的關鍵性因素[9]。本實驗通過股靜脈注射將BMSCs移植到MCAO大鼠模型體內，通過促進栓塞區血管新生降低神經功能的損失。本研究發現栓塞區腦組織血管新生明顯多于對照組，BMSCs組有大量微血管生成，提示可能是VEGF表達上調，隨著時間延長，數量增加，在第14天時數量開始下降，進一步Westernblot、PCR實驗也證明了這一推論。

目前廣大學者認為與血管新生密切有關的是VEGF和Notch信號通路。病理條件下，Notch信號通路與血管形成密切相關，而VEGF可以通過Notch信號通路發揮生理作用，促進血管生成[10-11]。VEGF是特異性促血管生成因子，對血管新生的起始具有關鍵性作用，其中VEGF165的作用最明顯。MACO動物模型顯示，MACO后24小時血管內皮細胞開始明顯增生[12]，在本實驗中，BMSCs移植到腦栓塞大鼠體內后發現VEGF165蛋白、mRNA相較于假手術對照組明顯升高，說明BMSCs移植能夠通過增加VEGF165的表達從而促進血管新生。

研究發現，許多信號通路參與了血管新生的過程，其中Notch信號的調節作用尤為突出[13]，另外，Notch信號激活可以促進BMSCs移植作用，使心肌梗死區BMSCs向內皮細胞分化,促進缺血心肌中毛細血管新生[14],此外還對一些組織的血管生成具有調控作用[15]。在本實驗中，BMSCs移植到腦栓塞大鼠體內后發現Notch1蛋白、mRNA相較于假手術對照組明顯升高，表明BMSCs移植后可能通過激活Notch信號通路而促進腦動脈栓塞組織中VEGF165的表達，從而促進形成新生的血管[2]。

組織器官缺血后VEGF和Notch信號通路均與血管新生有著密切關系。VEGF能刺激血管的新生，是血管生成的重要因素，VEGF表達增加激活Notch信號通路。本實驗檢測了腦栓塞組織區的VEGF165蛋白、mRNA與Notch1蛋白、mRNA，結果顯示，MCAO組、BMSCs組VEGF165蛋白、mRNA與Notch1蛋白、mRNA表達較假手術對照組明顯升高。表明Notch信號通路可以促進BMSCs分化，提示VEGF調控血管生成過程中，Notch信號通路也參與血管新生，起著重要調控作用。

綜上所述，BMSCs移植可對腦動脈栓塞大鼠有很好的治療效果，能夠使BMSCs在栓塞區存活，加快促進血管新生，提高VEGF、Notch表達，激活VEGF/Notch通路，促進受損神經功能的恢復，在一定程度上保護了腦組織，為臨床治療腦栓塞提供了新的治療方法。但VEGF/Notch通路在BMSCs移植促進腦微血管形成中的具體機制需要廣大學者的進一步探索。