慢性阻塞性肺疾病的早期診斷生物標(biāo)志物初篩

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(1.廣州市第十二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510620；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3.中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省環(huán)境資源 利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.中國科學(xué)院大學(xué)；5.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所 中國科學(xué)院區(qū)域大氣環(huán)境研究卓越創(chuàng)新中心)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界的常見多發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，每年導(dǎo)致全球超過三百萬人死亡，其中我國占一百多萬，已成為全球(特別是我國)的重要公共健康問題[1-7]。COPD的早期診斷和治療能顯著改善患者的生命質(zhì)量、降低死亡率，并減少其醫(yī)療費(fèi)用。然而，當(dāng)前COPD的診斷方法仍是傳統(tǒng)的肺功能檢查，但該方法存在不適用于所有年齡段的患者和無法進(jìn)行早期診斷等諸多的局限性[8-10]。因此，突破傳統(tǒng)診斷方法的局限性，發(fā)展新的COPD早期診斷方法則顯得十分重要。

人體呼出氣體中的揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)攜帶大量的生理和病理信息，因此，基于呼出氣VOCs分析將可為COPD的診斷提供有效的生物標(biāo)志物，從而為快速評估疾病狀態(tài)提供新的方法學(xué)支持[11]。但目前有關(guān)于COPD呼吸氣診斷方面的研究相對較少，且存在：(1)主要采用離線采樣和離線分析，無法滿足快速診斷的要求；(2)前期研究結(jié)果千差萬別，至今沒有獲得普適性的生物標(biāo)志物等局限性[9, 12-18]。因此，本研究利用在線分析儀器質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-飛行時間質(zhì)譜儀(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)對比檢測與分析15例COPD患者和50位與之匹配的健康者的吸入氣和呼出氣中VOCs的組分及濃度，期望獲得更多的COPD的生物標(biāo)記物，豐富生物標(biāo)記物庫，為建立COPD呼吸氣早期診斷的方法提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究招募了65名志愿者：15例COPD患者和50位與之匹配的對照健康者。15例患者為廣州市第十二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的COPD患者。所有受試患者均經(jīng)臨床診斷確認(rèn)患有COPD，符合慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative for chronic obstructive lung disease, GOLD)標(biāo)準(zhǔn)[19]。根據(jù)GOLD指導(dǎo)方針，受試患者中5例被診斷為輕度或中度COPD(GOLD階段I/II)，10例被診斷為重度或極重度COPD(GOLD階段III/IV)。在呼吸氣樣品采集前，所有受試者依據(jù)國際GOLD指南推薦的呼吸量測定法，進(jìn)行肺功能檢查來確定患者的COPD發(fā)展階段，主要的分析參數(shù)包括一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 1 second, FEV1)、FEV1%預(yù)測值、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)和FEV1/FVC。本研究獲得廣州市第十二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均自愿簽署知情同意書和填寫個人信息表，具體包括性別、年齡、身高、體重、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、吸煙喝酒狀況和個人及家族的過去病史。COPD患者和健康對照組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)見表1。

表1 COPD患者和健康對照組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

1.2主要儀器與裝置肺功能測定儀(型號： MICRO QUARK；廠家：COSMED the Metabolic Company，羅馬，意大利)；2L泰德龍采氣袋(廠家：大連德霖氣體包裝有限公司，大連，中國)；質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-飛行時間質(zhì)譜儀(型號：PTR-TOF 2000；廠家：Ionicon Analytik GmbH，因斯布魯克，奧地利)。

1.3呼吸氣采集和分析在采集呼吸氣樣品之前，所有受試者被要求在采樣前至少一個小時內(nèi)不能吸煙、吃食物、喝飲料(除水以外)和刷牙，并用純凈水漱口。其中，受試患者還須在采樣前24小時停止使用長效支氣管擴(kuò)張劑或12小時停止吸入短效支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素。

使用2L泰德龍采氣袋采集每位受試者的一個吸入氣(即周圍環(huán)境空氣)樣品和兩個呼出氣樣品。吸入氣采集是使用玻璃注射器將受試者周圍環(huán)境空氣注入氣袋中；而呼出氣采集則是通過一段特氟龍管由受試者將肺部氣體經(jīng)口腔多次吹入采氣袋，且選擇采集呼出潮氣末期的氣體樣品。所有樣品均在室溫下保存，樣品采集后2 h內(nèi)完成分析。

1.4質(zhì)量保證和質(zhì)量控制本研究應(yīng)用PTR-TOF Data Analyzer(version 4.49)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[20]，選用水合氫離子同位素(H318O+,m/z21.022)、水團(tuán)簇離子同位素(H518O16O+;m/z39.033)、質(zhì)子化的丙酮((C3H6O)H+;m/z59.049)和質(zhì)子化的1,2,4-三氯苯((C6H3Cl3)H+,m/z180.937)進(jìn)行質(zhì)量校準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997。各化合物的靈敏度，即標(biāo)準(zhǔn)化的信號響應(yīng)(normalized counts per second, ncps)與其對應(yīng)濃度水平(part per billion by volume, ppbv)，在10.51～40.08 ncps/ppbv之間。本研究中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即為靈敏度，也是校正因子[21]。方法檢測限在0.039～0.086 ppbv之間，分析儀器的精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于7%，準(zhǔn)確度在±13%之間。

考慮吸入氣和呼出氣中濕度的巨大差異對目標(biāo)化合物信號響應(yīng)的影響，本研究應(yīng)用de Gouw等[22]建議的方法計(jì)算生成物離子信號標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)。根據(jù)Stockwell等[21]和Sarkar等[23]提議的質(zhì)量相關(guān)的靈敏度計(jì)算法，對本研究報(bào)道的但標(biāo)氣不含有的化合物進(jìn)行定量計(jì)算。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)數(shù)據(jù)通過正態(tài)性檢驗(yàn)(P>0.05)時，t檢驗(yàn)被用于檢驗(yàn)兩類獨(dú)立樣本的統(tǒng)計(jì)性差異。而當(dāng)正態(tài)分布、方差齊性不能達(dá)到t檢驗(yàn)的要求時，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法：曼-惠特尼U檢驗(yàn)。雙尾顯著性檢驗(yàn)被用于檢驗(yàn)研究結(jié)果，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD患者與健康對照組呼出氣對比本研究從質(zhì)譜圖中共提取出285個質(zhì)量峰。首先，篩選出內(nèi)源VOCs，當(dāng)某化合物在呼出氣中濃度高于吸入氣中濃度，則該化合物可能是內(nèi)源化合物，會被選為候選生物標(biāo)記物。然后，為了消除環(huán)境因素影響，候選標(biāo)志物顯示的濃度均是呼出氣濃度減去吸入氣濃度的結(jié)果。最后，通過統(tǒng)計(jì)分析COPD患者與健康對照組呼出氣VOCs濃度，發(fā)現(xiàn)18種VOCs在這兩類人群中差異具有顯著性(P<0.05，表2)。因此，這18種VOCs被確定為COPD呼出氣的生物標(biāo)志物，它們分別是丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、乙酸、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、環(huán)己二烯、戊烯醛、2-甲基丁醛、乙酸乙酯、丁酸、苯酚、二甲基苯甲醛、3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(羅勒烯)和松油醇。

表2 COPD患者與健康對照組呼出氣VOCs標(biāo)志物 的濃度及P值統(tǒng)計(jì)

此外，丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者和健康志愿者之間具有更高水平的顯著性差異(P<0.001)，它們的濃度在COPD患者和健康對照組之間沒有重疊交集。因此，上述7種VOCs被認(rèn)為是顯著的COPD生物標(biāo)志物。

2.2 COPD早期與晚期患者呼出氣對比統(tǒng)計(jì)分析顯示COPD早期(包括輕度和中度)與晚期(包括重度和極重度)患者的呼出氣標(biāo)志物濃度差異無顯著性(P>0.05，表3)。

3 討論

COPD是全世界的常見多發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，每年導(dǎo)致全球超過三百萬人死亡[24]。尤其是在我國，COPD更為盛行，從1990年～2013年它一直高居全國第三大致死病因，每年大約一百萬人死于該病，約占全球COPD死亡人數(shù)的三分之一[3-4]。早期診斷和治療是改善COPD患者的生命質(zhì)量、延長壽命、降低死亡和降低醫(yī)療費(fèi)用的關(guān)鍵。然而早期COPD呼吸癥狀在臨床表現(xiàn)不明顯，現(xiàn)行的肺功能檢查不能對該階段疾病做出全面準(zhǔn)確的診斷[9]。因此，發(fā)展一種非侵入性且快捷的COPD早期診斷方法，則具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用意義。基于呼出氣VOCs生物標(biāo)志物分析的COPD診斷方法具備上述的優(yōu)點(diǎn)，將是一種全新的評估COPD手段，從而為COPD的早期診斷提供新的思路。

表3 COPD早期與晚期患者呼出氣VOCs標(biāo)志物 的濃度及P值統(tǒng)計(jì)

本研究通過對比分析獲得18種COPD的特征性呼氣生物標(biāo)志物，其中有5種化合物與前人的研究一致：羅勒烯和松油醇與Van Berkel等[12]研究發(fā)現(xiàn)一致；2-甲基丁醛則被Cristescu等[13]認(rèn)為是肺氣腫(COPD晚期癥狀)的生物標(biāo)志物；乙酸和苯酚則分別為Phillips等[14]及Gaida等[15]提出為COPD呼出氣生物標(biāo)志物；Allers等[16]在兩種檢測儀器中均發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物：2-戊酮與本研究現(xiàn)的生物標(biāo)志物2-甲基丁醛是同分異構(gòu)體，它們分子質(zhì)量均為86 amu。上述5種化合物可確定為COPD患者呼出氣的特征性生物標(biāo)志物，應(yīng)用于COPD的診斷。

本研究首次報(bào)道的13種COPD患者呼出氣特征性化合物：丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、環(huán)己二烯、戊烯醛、乙酸乙酯、丁酸和二甲基苯甲醛，特別是其中的丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者與健康者之間具有極顯著性差異(P<0.001，表2)，具有作為COPD診斷生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值，但由于本研究招募到的COPD患者數(shù)不多，尚需進(jìn)一步的深入研究。

此外，本研究獲得的18種COPD生物標(biāo)志物在COPD早期與晚期階段濃度無顯著性差異，表明這些標(biāo)志物的濃度不會隨著COPD的惡化程度而發(fā)生變化，但與健康者比較具有顯著性的差異。因此，它們具有應(yīng)用于COPD早期診斷的價(jià)值。

本研究的不足之處：實(shí)驗(yàn)中患病受試者數(shù)目相對較少，僅有15名受試者。后續(xù)我們將招募更多的COPD患者與健康對照者，從而提供更加可靠的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

綜上所述，本研究初步篩選得到18種COPD患者的呼氣特征性化合物，豐富了COPD呼出氣的生物標(biāo)志物庫，其中5種與不同研究者基于不同國家或地區(qū)人群數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致，具有應(yīng)用于COPD早期診斷的價(jià)值。13種新報(bào)道的化合物具有應(yīng)用于COPD早期診斷的潛在價(jià)值，尚需后續(xù)進(jìn)一步的研究證實(shí)。