MiR-193b在肝癌組織中的表達及臨床意義

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(南華大學第一附屬醫院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

肝癌即肝細胞癌，是肝臟中最常見的腫瘤，發病率高，死亡率在各種惡性腫瘤中占第二位，對人類健康危害極大。microRNAs(miRNAs)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區結合，導致其翻譯過程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉錄后水平特異性影響靶基因表達[1]。近年研究發現，miRNAs失調與肝癌的發生、發展密切相關[2-3]。MiR-193b的編碼基因位于人第16號染色體p13.12上，在非小細胞肺癌、食管鱗癌組織中呈低表達[4-5]。本課題組前期研究表明，miR-193b通過caspase-3途徑降低HepG2細胞對順鉑的耐藥性[6]，提示這種miRNA具有抗肝癌作用。然而，miR-193b在肝癌組織中的表達及與患者預后的關系仍不清楚。本研究采用熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測miR-193b在肝癌組織及相應的癌旁非腫瘤組織中的表達，從而探討其在肝癌發生、發展中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料40例原發性肝癌組織及相應的癌旁非腫瘤組織標本均為本院2008年1月～2011年12月手術切除后的經石蠟塊保存的組織標本，并經病理檢測確定，所有病例術前未行化療和放療，亦未合并其它系統惡性腫瘤。根據檔案室患者病歷資料，按年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期情況及淋巴結轉移進行分類，并記錄5年內的生存情況。本實驗經南華大學第一附屬醫院倫理委員會批準，同時征得患者或者其家屬的知情同意。

1.2主要試劑Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix分別由美國Promega公司、上海生工生物工程公司、日本 Toyobo公司提供。

1.3熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 采用Trizol試劑提取組織標本中的總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.22設計本實驗所使用的引物，并由華大基因生物科技有限公司合成，序列如下：miR-193b正義：5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′，反義：5′-CTGTGCGTGTGACAG CGGCTGA-3′；以U6為內參， U6引物為：正義：5′-CTCG CTTCGGCAGCACA-3′，反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。在Roach480 qRT-PCR儀上進行PCR反應，反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性15 s，55℃復性30 s，70℃延伸30 s，總共40個循環。利用ΔΔCt值法定量目的基因miR-193b表達水平。實驗過程中同時設置陰性、陽性對照。

1.4統計學分析通過SPSS14.0軟件包進行統計學分析，兩組均數比較行t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，生存率分析利用Kaplan-Meier法，以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-193b在肝癌組織中的表達利用qRT-PCR檢測miR-193b在肝癌組織及相應的癌旁組織中的表達，其qRT-PCR的溶解曲線見圖1，從曲線上分析，各個標本的熔點基本上都集中在89℃左右，可以認為qRT-PCR的特異性較好，結果分析發現肝癌組織miR-193b表達水平明顯低于癌旁組織，差異有顯著性(t=5.32,P<0.01)(圖2)。

圖1 miR-193b的qRT-PCR的溶解曲線

圖2 兩組miR-193b表達水平比較 與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2 miR-193b表達與肝癌臨床病理特征分析為了進一步探討miR-193b與肝癌臨床病理特征之間的關系，以中位數為界值(1.68)將其分為miR-193b低表達組(≤中位數)和miR-193b高表達組(>中位數)，分別包括16、24個樣本。如表1所示，miR-193b表達與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小無相關性(P>0.05)。

表1 miR-193b表達與肝癌臨床病理特征的關系

續表

臨床參數nmiR-193b表達高(n=16)低(n=24)χ2PTNM分期 I+II18101526.53<0.05 III+IV2266淋巴結轉移 無1371621.46<0.05 有2795

2.3 miR-193b表達與肝癌患者生存的關系對40例肝癌患者術后生存狀況進行分析，相對于miR-193b低表達組，miR-193b高表達組患者5年生存率明顯增加，差異有統計學意義(χ2=25.38,P<0.05)，見圖3。

圖3 肝癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

肝癌是最常見的消化系統腫瘤之一，惡性程度高，預后差，其發生是一個多因素、多步驟的復雜過程，與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染及黃曲霉素、酒精、亞硝胺類物質的長期攝入相關，但其發病機制仍未完全闡明。肝癌發病隱匿，許多患者確診時已到中、晚期，由于已發生局部腫瘤廣泛浸潤和/或遠處轉移而喪失了最佳的治療時機。近年來，盡管已采取包括手術、放化療在內的積極治療措施，5年生存率仍達不到預期水平，同時具有較高的復發傾向[7]。因此，深入研究肝癌的發病機制并從中找出有效的分子標記物對于早期診斷、改善患者預后具有十分重要的意義。

隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的來臨，包括miRNAs在內的非編碼RNA已成為生命科學最熱門的研究領域之一。作為一種多效性因子，miR-193b在細胞的增殖、分化、凋亡、自噬及血管生成等生物學過程中發揮重要作用。研究表明，miR-193b在腫瘤形成和發展中具有多重功能，扮演著抑癌基因的角色。例如，Hulin，等[8]用miR-193b mimic處理乳腺癌細胞，發現外源性給予miR-193b拮抗細胞遷移及新生血管形成。下調miR-193b表達則增加尿激酶型纖溶酶原激活物水平，進而促進乳腺癌細胞侵襲與轉移[9]。Zhang，等[10]報道，miR-193b在卵巢癌組織中表達下調，當其過表達時可顯著抑制卵巢癌細胞A2780增殖，并增加紫杉醇化療敏感性。在敲除頭頸鱗狀細胞癌FaDu細胞系的 miR-193b基因后，細胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯提高[11]。我們的前期研究也發現，miR-193b通過靶向沉默髓細胞白血病基因-1抑制肝癌細胞增殖，并誘導其凋亡[12]。本研究結果顯示，肝癌組織中miR-193b 表達水平較癌旁非腫瘤組織降低；miR-193b表達與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關，但與年齡、性別、腫瘤大小無相關性；miR-193b高表達組患者5年生存率明顯高于miR-193b低表達組，這些結果表明miR-193b可能在肝癌的發生、發展中扮演重要作用，可作為評估腫瘤惡性程度及判斷預后的分子標記物，但具體作用機制仍有待進一步研究。隨著研究的深入，miR-193b可望成為肝癌防治的一個潛在的、有價值的靶點。