亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與高同型半胱氨酸血癥、高脂血癥及代謝綜合征的相關性研究

張 萍, 萬 萍, 張忠東, 朱燕忠, 許黎霞, 周 琳

(1. 江蘇省太湖療養院，江蘇 無錫，214086;2. 南京醫科大學附屬無錫市精神衛生中心 藥學部，江蘇 無錫，214000)

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-葉酸代謝中的一個關鍵酶[1-2]。MTHFR基因具有多態性，若其基因677位C→T或(和)1298位A→C突變，則會明顯降低MTHFR的活性，從而直接影響Hcy在體內的代謝，引發高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[3-4]。相關研究[5]表明, MTHFR基因突變與其他疾病具有相關性。本研究探討MTHFR基因突變與HHcy合并代謝綜合征(MS)以及高脂血癥(HL)合并MS的關系，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院2017年1—12月收治的MS患者98例作為觀察組, MS診斷標準參照2005國際糖尿病聯盟(IDF)標準，其中男83例，女15例; 年齡30～66歲，平均(51.67±9.44)歲。另選擇同期在本院進行健康體檢志愿者49例作為對照組，其中男24例，女25例; 年齡27～64歲，平均(47.06±7.40)歲。2組受試者性別、年齡等基本資料比較無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。

1.2 分組方法

根據是否合并HHcy, 將觀察組患者進一步分為MS合并HHcy組、MS未合并HHcy組。MS合并HHcy組55例，其中男47例，女8例; 年齡39～65歲，平均(50.33±9.08)歲。MS未合并HHcy組43例，其中男36例，女7例; 年齡40～68歲，平均(52.14±9.47)歲。2組患者性別、年齡等基本資料比較無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。HHcy診斷標準為血液中Hcy的濃度高于15 μmol/L。

根據是否合并HL, 觀察組患者又可分為MS合并HL組、MS未合并HL組。MS合并HL組41例，其中男35例，女6例; 年齡39～67歲，平均(50.49±9.12)歲。MS未合并HL組57例，其中男48例，女9例; 年齡39～68歲，平均(51.77±9.38)歲。2組患者在性別、年齡等基本資料方面比較無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。HL診斷標準為空腹血清總膽固醇>5.17 mmol/L, 甘油三酯>1.71 mmol/L。

1.3 PCR-RFLP技術檢測C667T與A1298C基因多態性

1.3.1 基因組DNA抽提: 總 DNA抽提試劑盒為AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒。嚴格按照試劑盒說明書的操作流程進行基因組DNA抽提。

1.3.2 基因分型: PCR擴增SNP位點所在片段: ① 在1.5 mL離心管中分別加入200 μL PCR-buffer (10×), 60 μL Mg2+(100 mmol/L), 200 μL dNTP (20 mmol/L), 20 μL Taq酶(5 U/μL), 400 μL Q-solution (4×), 40 μL primer (5 pmol/L), 最后加入980 μL去離子水。充分混勻后離心，再取19 μL分裝在200 μL的PCR反應管中，最后再加入1 μL基因組DNA。② 在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上設置如下程序: 95 ℃變性120 s, 40個循環，每個循環有3個溫度, 94 ℃下30 s, 56 ℃下90 s, 65 ℃下30 s, 最后65 ℃延伸600 s。③ 反應結束后，取2 μL反應產物在3.0%瓊脂糖膠、0.5×TBE中電泳，檢測反應是否成功。

PCR產物的連接酶檢測反應: ① 在PCR擴增產物中加入等體積雙蒸水(ddH2O)稀釋，作為連接反應的模板。② 在1.5 mL離心管中分別加入100 μL buffer (10×), 100 μL Probe Mix, 5 μL連接酶, 695 μL去離子水。充分混勻后離心，再取9 μL分裝在200 μL的PCR反應管中，最后再加入1 μL PCR反應產物。③ 在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上設置如下程序: 95 ℃變性120 s, 35個循環，每個循環有2個溫度, 94 ℃下30 s, 50 ℃下120 s。將PCR反應管放入PCR儀進行連接反應。④ 各取1 μL LDR連接產物與0.6 μL ABI GS-500 ROX熒光標記分子量標準和10 μL hidi上樣液混合, 95 ℃加熱變性2 min, 冰中驟冷，上3730毛細管電泳，應用Genemapper軟件進行數據分析和基因分型。

1.4 觀察指標

比較MS合并HHcy組與MS未合并HHcy組, MS合并HL組與MS未合并HL組，以及觀察組與對照組C667T與A1298C位點基因型情況，判斷基因與MS合并HHcy的相關性，基因與MS合并HL的相關性，以及基因與MS的相關性。

1.5 統計學處理

采用SHEsis軟件計算各組基因型頻率及其等位基因頻率，計算Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，計算比值比(OR值)和95%可信區間(CI),P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測比較

MTHFR C667T與A1298C突變位點基因型和等位基因頻率分布經過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,P值均大于0.5, 表明MTHFR基因型分布在各組人群中均符合遺傳平衡。

2.2 MS合并HHcy組與MS未合并HHcy組患者基因頻率分布位點情況

MS合并HHcy組與MS未合并HHcy組患者A1298C位點的基因型無顯著差異(P>0.05), 而C667T位點的基因型存在顯著差異(OR=2.3,P<0.05), 提示在MS患者中, MTHFR C667T基因突變可能是誘發HHcy的高危因素。見表1。

2.3 MS合并HL組與MS未合并HL組患者基因頻率分布位點比較

MS合并HL組與MS未合并HL組患者C667T與A1298C兩個位點基因型無顯著差異(P>0.05), 提示在MS患者中, HL的發病與MTHFR基因的多態性并無顯著相關性。見表2。

表1 MS合并HHcy組與MS未合并HHcy組患者基因頻率分布比較[n(%)]

表2 MS合并HL組與MS未合并HL組患者基因頻率分布比較[n(%)]

2.4 觀察組與對照組基因頻率分布位點比較

觀察組與對照組患者C667T與A1298C兩個位點的基因型無顯著差異(P>0.05), 提示MS的發病與MTHFR基因的多態性并無顯著相關性。見表3。

表3 觀察組與健康對照組基因頻率分布比較[n(%)]

3 討 論

人類的MTHFR基因由11個外顯子與10個內含子構成。MTHFR基因共有20多個突變位點，而其中以C667T與A1298C兩個突變位點最為常見。C667T與A1298C突變位點具有明顯的分布差異[6]。C667T基因位于MTHFR基因的第4個外顯子，由于胞嘧啶(C)突變成了胸腺嘧啶(T), 從而導致丙氨酸變換成纈氨酸，因此酶的活性降低。A1298C基因位于MTHFR基因的第7個外顯子，由于胞嘧啶(C)突變成了腺嘌呤(A), 因此谷氨酸變換成丙氨酸。該突變雖然不會影響酶的耐熱性，但是卻顯著降低了酶的活性，且主要影響酶的調節。C667T與A1298C突變對于酶活性的降低具有協同作用[7]。

在人體中，有3個關鍵酶參與到Hcy的代謝中，分別為MTHFR、蛋氨酸合成酶、胱硫醚-β-合成酶。MTHFR在Hcy的代謝過程中扮演著重要的角色[8]。當MTHFR基因出現突變而降低其酶的活性，則會引起血漿Hcy水平的顯著增高[9]。多項研究[10-11]表明, MTHFR C667T和(或)A1298C基因發生突變，可使患者血液中Hcy水平顯著增加，出現HHcy的癥狀。本研究中, MS合并HHcy組與MS未合并HHcy組患者MTHFR C667T基因突變與HHcy的發生具有顯著相關性(P<0.05), 表明HHcy的發病與MTHFR C667T基因突變具有密切相關性。

本研究結果發現，在C667T多態性的基因型中, CC基因型攜帶者Hcy水平低于CT基因型攜帶者，提示CC基因可能是HHcy的保護因素。相關文獻[12]表明，在A1298C多態性基因型中, AC基因型攜帶者Hcy水平顯著低于AA基因攜帶者, AC基因可能是HHcy的保護因素，與本研究的結果不一致，考慮原因一方面是A1298C基因型存在一定的地域差異; 另一方面是本研究樣本量較少，需要進行更大樣本群體的研究。

相關研究表明, MTHFR基因發生突變后，導致MTHFR酶活性的降低，進一步影響了DNA、RNA的合成以及DNA的甲基化，導致患者血液中的Hcy濃度提高，形成N-同型半胱氨酸酸化低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C), 最終引發HL。本研究中, MS合并HL組與MS未合并HL組患者MTHFR C667T與A1298C基因突變與HL無顯著相關性(P>0.05)。本研究還進一步比較了觀察組與對照組中MTHFR C667T與A1298C基因突變的情況，結果發現，觀察組與對照組MTHFR C667T與A1298C基因型無顯著差異(P>0.05)。對于上述2個陰性結果，可能的原因是由于本次實驗入組的患者較少，所得結果可能存在一定的偏倚，并不能夠正確反映臨床的實際情況，因此MS以及HL的發生與MTHFR C667T與A1298C基因突變是否存在相關性，還需要進行進一步深入研究。