油茶炭疽病病原菌的分離與鑒定

劉小玉，余鳳玉，付登強，楊偉波，賈效成，陳良秋

（中國熱帶農業科學院椰子研究所/油茶研究中心，海南文昌571339）

油茶為我國所特有，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種，在我國已有2300多年的栽培歷史。它適應性廣，主要生長在南方，以湖南、江西、廣西、海南等地為主。油茶炭疽病在我國油茶產區普遍發生，常引起嚴重落果、落蕾、落葉、枯枝，甚至整株衰亡[1]。病害落果率通常在20%～40%，嚴重時達60%以上。晚期病果雖可采收，但種子含油量僅為健康種子的一半，損失嚴重[2]。加強對油茶炭疽病的研究力度，提高油茶炭疽病的診斷和防治技術，是油茶生產的當務之急。因此，本文通過組織分離法對油茶炭疽病的病原菌進行分離、培養及致病性檢測，并通過形態學和序列分析的方法進行鑒定，旨在明確其種類，為防治該病菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 試驗材料

采于中國熱帶農業科學院油茶研究中心油茶種質資源圃的感染炭疽病的病油茶葉片。

1.1.2 PDA培養基

去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

采用常規組織分離法分離病原菌[3]。切取病健交界處小塊病變組織（5 mm×5 mm），經70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞浸泡1 min，后用無菌水漂洗3次，晾干移至PDA平板培養基上，置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養。待長出菌絲后挑取菌落邊緣菌絲接種至新PDA平板上進行純化，再轉接到試管斜面上培養4 d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 致病性檢測

按照柯赫氏法則進行致病性檢測。從分離病原菌的油茶植株上，選取健康嫩葉，用自來水沖洗干凈，2%次氯酸鈉表面消毒2 min，然后無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干表面水分，放置于無菌高濕的培養皿中。將純化保存的病原菌活化，接種至PDA培養基上，25℃黑暗條件下培養3～5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣切取5 mm的菌絲塊，放置于培養皿中的油茶葉片洞口處。設空白PDA培養基為對照，重復3次。蓋上蓋子，放置于25℃恒溫培養箱培養，3 d后觀察發病情況。發病后從病斑上再分離病原菌，檢測是否與接種菌株相同。

1.2.3 病原菌形態學觀察

將純化后的病原菌接種到PDA培養基平板上，在25℃恒溫培養箱中黑暗培養，定期觀察記錄菌落形態學特征，并對病原菌分生孢子和厚垣孢子進行顯微形態觀測。

1.2.4 DNA提取、PCR擴增及序列測定

將分離菌株在PDA培養基上培養5～7 d后，收集新鮮的濕菌體0.1～0.3 g，用液氮在研缽中磨碎，裝入1.5 mL的離心管中，然后用基因組DNA快速提取試劑盒（真菌）提取DNA。

PCR擴增所用引物為ITS區通用引物ITS1和ITS4。PCR反應總體積為25 μL，包括10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL，ITS1 和 ITS4 各 1 μL，dNTP Mix 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR 反應程序為：95℃預變性 3 min；95℃變性 30 s，55 ℃復性 30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。取5 μLPCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察、并拍照保存。將PCR產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行比對分析，采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 油茶炭疽病癥狀

油茶葉片感染膠孢炭疽病菌后，病斑多從葉緣或葉尖處發生，呈半圓形或不規則形，黑褐色，具水漬狀輪紋，邊緣紫紅色。老病斑中心灰白色，內有輪生小黑點，使病斑呈波紋狀，如圖1所示。

圖1 油茶炭疽病病癥Fig.1 Anthracnose disease of Camellia oleifera

2.2 致病性測定結果

致病性檢測發現菌株7-2能引起健康油茶葉片發病，對照組未見發病。第4 d起已出現褐色病斑，隨后病斑上產生白色菌絲。隨著時間推移，病斑逐漸擴大，乃至蔓延到整個葉片。從這些病斑上再次分離病原菌，發現所獲得的分離物與接種菌一致，表明所分離的菌株為引起油茶炭疽病的病原菌。

2.3 病原菌的分離結果與形態特征

采用常規組織塊法分離得到菌株，編號為7-2，保存于中國熱帶農業科學院油茶研究中心。菌株7-2在PDA培養基上培養后，菌落為圓形并呈等徑輻射生長，無褶皺，邊緣整齊，菌絲初期為白色，后逐漸變為灰黑色，氣生菌絲生長旺盛，由白色變成灰白色，再漸變為深灰色絮狀（見圖2）。分生孢子單孢，無色，圓柱形或圓筒形，兩頭鈍圓，中間略凹，兩端不對稱，大小為(5.18～8.29)μm×(9.47～19.37)μm。這些形態特征與膠孢炭疽菌形態特征相符[4,5]。因此，初步確認菌株7-2為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

圖2 膠孢炭疽菌病原菌菌落Fig.2 Pathogenic bacteriacolony of Colletotrichum gloeosporioides

2.4 病原菌基因序列分析

經rDNA ITS1和ITS4引物對菌株7-2進行PCR擴增，獲得一條長度為577 bp大小的片段。將該序列與GenBank中核酸數據庫（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行同源性比較，發現菌株7-2序列與GenBank（序列登錄號：MH265979.1、MF800896.1）庫中登錄的膠孢炭疽菌的序列完全一致，同源性為100%，因此可以確定菌株7-2為膠孢炭疽菌。

3 結論

本研究通過形態學、分子生物學及致病性檢測，證明了引起油茶炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌。膠孢炭疽病菌是世界上最重要的致病菌之一，至少能夠侵染1000多種植物，主要危害寄主植物的葉片和果實，也可危害枝梢，引起葉斑、落葉、果實腐爛和枝梢枯死[6]。油茶果實被害初期在果皮上出現褐色小斑，逐漸擴大為黑色圓形病斑，有時數個病斑連接成不規則形，無明顯邊緣，后期病斑上出現輪生的小黑點。嫩葉受害時，病斑多從葉緣或葉尖處發生，呈半圓形或不規則形，黑褐色，具水漬狀輪紋，邊緣紫紅色。老病斑中心灰白色，內有輪生小黑點，使病斑呈波紋狀。枝梢受害，多發生在新梢基部，少數在梢中部，橢圓形或梭形，初為黑褐色，后變成黑色。花芽和葉芽受害變黑色或黃褐色，無明顯邊緣，后期呈灰白色，上生小黑點，嚴重時芽枯蕾落。另外，由于膠孢炭疽病菌寄主范圍非常廣泛，對大量的經濟作物如芒果[7]、建蘭[8-10]、橡膠[11]、梨、草莓和柑橘等易造成嚴重危害。可見準確鑒定膠孢炭疽病菌并有效防止該病害的發生、蔓延和危害，對促進我國種植業的安全生產，維護種植者利益，具有十分重要的現實意義。