利用重疊PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a

汪 偉， 孫春娃， 楊愛文， 金 皓， 姚 萍， 袁維維， 徐建明， 周玉珍

(淮陰師范學院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)技術重點實驗室，江蘇淮安 223300)

木質(zhì)纖維素是地球上儲量最豐富的可再生資源。近年來，各地露天大面積直接焚燒秸稈的現(xiàn)象時有發(fā)生，并且日趨嚴重。而秸稈焚燒不但造成嚴重的資源浪費，而且會排放大量的污染物，使得局部大氣和水環(huán)境質(zhì)量惡化，造成環(huán)境污染[1]。在礦物燃料資源日趨枯竭、環(huán)境日趨惡化的嚴峻形勢下，利用廉價的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)液體燃料和大宗化學品，可以有效地緩解能源和環(huán)境危機，促進全球經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。

纖維素酶是實現(xiàn)秸稈等廢棄木質(zhì)纖維素水解為單糖，繼而發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇和其他化工產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中最為關鍵的環(huán)節(jié)之一[4]。生物產(chǎn)纖維素酶的效率很低、生產(chǎn)成本高、酶活性低、用量大等因素限制了纖維素酶的推廣和應用[5]。絲狀真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物，其中木霉屬中的里氏木霉是最重要的代表菌株[6]。里氏木霉分泌的纖維素酶具有產(chǎn)量高、種類相對齊全等特點，也是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的主要菌株[7]。里氏木霉的纖維素降解酶的表達合成受到多級控制，然而大部分調(diào)節(jié)發(fā)生在轉錄水平。不同纖維素酶的編碼基因被共同調(diào)節(jié)，這意味著它們同時受到誘導或抑制，雖然誘導或抑制的程度不盡相同[8-10]。其中外切酶CBHⅠ(cellobiohydrolase Ⅰ)占里氏木霉分泌的纖維素酶組分的60%，其次為CBHⅡ(cellobiohydrolase Ⅱ)和EG2。而β-葡萄糖苷酶在里氏木霉分泌的纖維素酶組分中含量最少，其酶活性較低，因此造成水解體系中纖維二糖的積累，由此可見，人為過量表達β-葡萄糖苷酶是提高纖維素酶整體酶活性的有效途徑之一。

有研究顯示，在細胞膜上1個通透酶負責將纖維二糖運送到細胞內(nèi)，從而誘導纖維素酶的合成[11]。然而，關于纖維二糖是否就是纖維素酶的誘導分子還不是很清楚。纖維二糖的誘導效果不如其位置異構體，如槐糖、龍膽二糖和昆布二糖，其中槐糖的誘導效果最好[12-13]。有研究者在用β-葡萄糖苷酶作用過的纖維素酶降解纖維素的溶液中分離得到纖維二糖的異構體，主要有槐糖，說明β-葡萄糖苷酶對纖維二糖不僅有水解作用，很可能還在纖維素酶誘導分子的合成過程中起到重要作用[14]。

相關研究還顯示，β-葡萄糖苷酶Cel1a有轉糖基作用的酶活性，可以催化纖維二糖得到槐糖、纖維三糖、纖維四糖等[14]。敲除里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a、cel3a或cel1b后，嚴重延遲了纖維素酶的表達時間，使得胞外纖維素酶的活性也有所降低(cel1a受到的影響最嚴重)，而添加強誘導物槐糖后又恢復了纖維素酶的正常表達[11，15-16]，說明β-葡萄糖苷酶在里氏木霉纖維素酶誘導物槐糖的形成過程中起著重要作用。1個不影響β-葡萄糖苷酶Cel1a的轉糖基作用的酶活性而降低了其水解酶活性的單個氨基酸的突變(V409F)提高了纖維二糖對里氏木霉纖維素酶的誘導作用[17]，進一步說明β-葡萄糖苷酶的轉糖基作用在纖維素酶的誘導合成過程中起到重要作用，因此，體內(nèi)過量表達β-葡萄糖苷酶不但能提高里氏木霉體內(nèi)纖維素酶的整體酶活性，更能研究其纖維素酶的誘導表達機制。本研究利用重疊PCR成功克隆β-葡萄糖苷酶cel1a，并使其受里氏木霉看家基因β-actin的啟動子(Pact)啟動，能夠在里氏木霉細胞內(nèi)持續(xù)過量表達，以期為后續(xù)研究β-葡萄糖苷酶在調(diào)控纖維素酶的酶活性及其表達過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)、二元載體pCAMBIA1300、里氏木霉Rut C-30均為筆者所在課題組保存。大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)感受態(tài)細胞由筆者所在實驗室制備。DNA回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、PCR DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶、RNase、dNTP、DNA marker、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ，均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成，DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank上里氏木霉基因組DNA中看家基因(β-actin)的啟動子(Pact)DNA序列和β-葡萄糖苷酶cel1a基因序列，設計PCR程序，分別擴增Pact(長度約為1 200 bp)和cel1a(長度約為2 200 bp)DNA片段XbaⅠ-Pact-F和Pact-cel1a-R、Pact-cel1a-F和cel1a-HindⅢ-R，考慮到后續(xù)要利用重疊PCR拼接2個基因片段為Pact-cel1a(長度約為3 400 bp)及其后續(xù)的克隆酶切位點，在擴增Pact的上游引物上添加XbaⅠ酶切位點 5′-TCTAGA-3′(用波浪線標出)，在下游引物上添加cel1a的5′端DNA序列(用下劃線標出)；在擴增cel1a的上游引物上添加Pact的3′端DNA序列(用下劃線標出)，在下游引物上添加HindⅢ酶切位點5′-AAGCTT-3′(用波浪線標出)。引物序列如下(加粗的為2個引物的重疊部分)：

XbaⅠ-Pact-F：5′-TATATATATCTAGACACAGCA-GAAGGGGGTTCCGTCAAC-3′ ；

Pact-cel1a-R：5′-GGGCAGCATTGTGACTGA-TTAATGTATGAAGCTGATGAAAG-3′；

Pact-cel1a-F：5′-ATTAATCAGTCACAATGCT-GCCCAAGGACTTTCAGTGG-3′；

cel1a-HindⅢ-R：5′- ATTATATATAAGCTTGCCATC-ATGGTGCTGCTGTTTCTG-3′。

1.3 啟動子Pact與cel1a的PCR擴增與純化

用冮潔等的方法提取里氏木霉Rut C-30基因組DNA[18]，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢查純度及其濃度后，以里氏木霉RutC-30基因組為模版，根據(jù)Pfu DNA 聚合酶說明書要求，用第1.2節(jié)中設計的引物分別擴增啟動子Pact和cel1aDNA片段。其PCR擴增程序均如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 36 s，70 ℃，30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃冷卻后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由于PCR產(chǎn)物較純，采用PCR純化試劑盒分別純化Pact、cel1aDNA片段。

1.4 重疊PCR連接Pact與cel1a

以第1.3節(jié)PCR擴增并純化的Pact和cel1a為DNA模板，按照Pfu DNA聚合酶說明書要求，以XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R為引物拼接Pact、cel1aDNA片段，并擴增Pact-cel1a。其PCR擴增程序均如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 36 s，70 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃冷卻后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由于出現(xiàn)多條PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大小合適的PCR產(chǎn)物。

1.5 融合DNA片段Pact-cel1a的克隆

由于引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R上分別設計有XbaⅠ、HindⅢ酶切位點，Pact-cel1a的兩端分別含有XbaⅠ、HindⅢ酶切位點。因此可以通過XbaⅠ、HindⅢ雙酶切把Pact-cel1aDNA片段克隆到二元載體pCAMBIA1300上。根據(jù)說明書要求選擇Tango buffer對Pact-cel1a和二元載體pCAMBIA1300分別進行XbaⅠ、HindⅢ雙酶切。分別純化Pact-cel1a、pCAMBIA1300雙酶切片段，按照T4連接酶試劑盒說明書，將酶切后的Pact-cel1a和pCAMBIA1300片段連接起來，得到重組質(zhì)粒Pact-cel1a-pCAMBIA1300，并用化學轉化法將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)感受態(tài)細胞中進行重組子的篩選、鑒定。從陽性克隆子中提取重組質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定，然后將所得陽性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 啟動子Pact與cel1a的PCR擴增

以里氏木霉RutC-30基因組為模版，分別以XbaⅠ-Pact-F和Pact-cel1a-R、Pact-cel1a-F和cel1a-HindⅢ-R為引物PCR擴增Pact、cel1a。取4 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，由圖1-a、圖1-b可以看出，PCR獲得了大小約為1 200 bp的Pact DNA片段和約為2 100 bp的cel1aDNA片段，與預期片段大小符合，表明PCR成功。由于PCR產(chǎn)物較為單一，采用PCR純化試劑盒分別純化Pact、cel1aDNA 片段，所得DNA濃度分別為12.5、11.5 ng/μL。

2.2 重疊PCR連接Pact與cel1a

2.2.1 重疊PCR的原理 重疊PCR的原理如圖2所示。以里氏木霉Rut C-30基因組DNA為模板，分別擴增Pact、cel1aDNA片段，由于本研究采用具有互補末端的引物cel1a-Act-F、cel1a-Act-R，使得Pact的3′端和cel1aDNA的5′端DNA序列相同，在PCR過程中，Pact和cel1aDNA片段可以互為模板，并將Pact和cel1aDNA片段拼接在一起，得到Pact-cel1a，如果用兩端引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R進行擴增，將得到Pact-cel1aDNA片段。

2.2.2 Pact-cel1aPCR擴增 以Pact、cel1a為模板，以XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R為引物，能將Pact、cel1a2個DNA片段連接起來，并擴增得到Pact-cel1a。由圖1-c可以看出，cel1a大小約2 100 bp，啟動子Pact大小為1 200 bp，拼接在一起約為3 400 bp。由圖1-c還可以看出，PCR產(chǎn)物的主要條帶在3 400 bp左右，說明拼接成功。由于PCR產(chǎn)物不單一，通過切膠回收得到Pact-cel1a的DNA濃度約為13.5 ng/μL。

2.3 Pact-cel1a的克隆

由于擴增Pact-cel1a時所用引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R分別含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位點，使得Pact-cel1a兩端分別含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位點。因此可以通過XbaⅠ、HindⅢ雙酶切而連接到二元載體pCAMBIA1300上。Pact-cel1a、pCAMBIA1300經(jīng)XbaⅠ、Hind Ⅲ雙酶切、純化后，利用T4連接酶將2個DNA片段連接在一起，并將連接反應產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α中。篩選陽性轉化子進行PCR及質(zhì)粒酶切鑒定。由圖3可以看出，上面的條帶為pCAMBIA1300的質(zhì)粒片段，大小約為9 kb，下面的條帶為Pact-cel1a片段，大小約為3.4 kb，因此可見載體和插入DNA片段與預期結果一致。重組質(zhì)粒測序結果也與GenBank中的序列完全一致，進一步說明本研究成功用重疊PCR將啟動子Pact與cel1a連接起來，并克隆到了pCAMBIA1300二元載體上，得到重組質(zhì)粒Pact-cel1a-pCAMBIA1300。

3 討論

重疊PCR 技術是采用具有互補末端的引物，分別擴增2個DNA片段，使得 PCR產(chǎn)物的引物互補部分形成重疊鏈，并在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段拼接起來[19]。因此，通過精心設計引物，可以將任意2個基因拼接連接形成2個目的基因的融合基因，中間無需任何目的基因的DNA序列，從而避免了依靠限制性內(nèi)切酶進行基因重組的麻煩，也避免了連接序列中可能出現(xiàn)的非目的基因的DNA序列[20]。

本研究成功利用重疊PCR技術將里氏木霉看家基因(β-actin)的啟動子(Pact)DNA序列與里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a的DNA序列拼接在一起，使得cel1a基因在里氏木霉內(nèi)能由看家基因(β-actin)的啟動子(Pact)驅動，能夠在里氏木霉細胞內(nèi)持續(xù)過量表達，從而增加了β-葡萄糖苷酶cel1a的表達量，有望提高纖維素酶的整體酶活性，今后也可以進一步研究與證實β-葡萄糖苷酶cel1a在里氏木霉纖維素酶表達調(diào)控中的作用。本克隆方法的建立為后續(xù)研究其他β-葡萄糖苷酶在里氏木霉纖維素酶表達調(diào)控中的作用，以及利用強弱不同的啟動子控制β-葡萄糖苷酶在里氏木霉中的表達水平及其細胞定位奠定了技術基礎。