APPL1在肺癌組織中的的表達及其與EGFR的關系＊

朱贊雷 ，陳碧嬛 ，王建 ，張敏 ，樂永宏 ，賴慶文

(江西省贛州市人民醫院，1、呼吸科；2、心內科；3、病理科；4贛南醫學院第一附屬醫院呼吸科，贛州 341000)

肺癌是人類健康最具有威脅的殺手之一。在我國，肺癌的發病率、死亡率已經成為所有惡性腫瘤之首，其中在男性兩者均是居第一位，而在女性發病率為第二位（低于乳腺癌），但死亡率居第一位[1]。由于肺癌早期時癥狀少，甚至沒有癥狀，臨床治療效果差，5年存活率低。因此，尋找新的診斷方法及新的治療靶點，能讓我們在早期診斷及靶向治療方面看到新的方向。APPL1(Adaptor protein containing PH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1)是近年來發現的一個銜接蛋白、調節蛋白，介導脂聯素的信號轉導。它不但參與了葡萄糖和脂類的代謝，而且參與了脂連素介導的肥胖相關腫瘤的發生發展，如肝細胞肝癌。同時，APPL1接受細胞外表皮生長因子和氧化應激的刺激，與Rab5a在內涵體上相互結合，將生長增殖信號轉導至細胞核內，進而引起基因表達的變化。APPL1在脂聯素信號轉導方面、2型糖尿病、結腸癌、乳腺癌[2]、肝癌等方面的研究已成為最近國外研究的熱門，但是關于其與肺癌的關系的研究甚少。為了明確APPL1在肺癌組織中的表達及其與EGFR表達的關系，我們對50例肺癌組織及50例癌旁組織進行免疫組化檢測，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集贛州市人民醫院2012年3月-2014年10月手術切除、有病理依據的肺癌的標本50例，對照組為距腫瘤邊緣5cm處癌旁正常組織。所有肺癌病例均為原發性肺癌，經彩超、CT、電子支氣管鏡等檢查排除轉移性肺癌，排除感染性病灶。其中男41例，女9例，平均年齡（59.64±9.44）歲(36-75歲)；病理分型：腺癌 25例，鱗狀細胞癌21例，小細胞癌4例；TNM分期：I期16例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例、Ⅳ期2例；術前未經過放、化療以及靶向治療。臨床分期標準參考2009 IASLC國際肺癌分期(第七版)[3]。所用標本均為手術切除的大標本，將距腫瘤邊緣5cm處肺組織作為正常組織對照；兩組分別經4%甲醛液固定，然后石蠟包埋，3um連續切片等待免疫組織化學實驗。

1.2 方法 免疫組織化學檢測：應用Envision免疫組化法，兔抗人APPL1多克隆抗體（ab128591）為美國Abcam公司產品，兔抗人EGFR多克隆抗體為福州邁新公司產品。用已證實的APPLl陽性片（胎兒心臟組織的免疫組化片）作為陽性對照；用PBS緩沖液來代替一抗，作為陰性對照。分別檢測APPLI蛋白和EGFR蛋白在肺癌細胞以及癌旁正常組織細胞中的分布、定位以及表達強度。APPLl陽性染色為細胞胞漿中的棕黃色顆粒。綜合考慮免疫組化的細胞陽性強度及細胞陽性率，采用半定量積分進行分級，積分=染色細胞陽性率x染色強度。每張染色切片中隨機選取5個高倍鏡視野(10×40)，取每個視野中計數200個細胞。判斷標準： 染色細胞陽性率：＜5%、6%-20%、21%-50%、＞50%分別計0分、1分、2分、3分；染色強度：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0分、1分、2分、3分；2 種計分相乘，0 分陰性（-），1-3 分弱陽性（+），4-6陽性（++），7-9強陽性（+++）。 EGFR 標記以細胞漿和細胞膜出現了棕黃色顆粒為陽性結果，腫瘤細胞比率＞10%為陽性。

1.3 統計學處理 所有數據均采用SPSS 18．0統計軟件統計，肺癌組織中與癌旁正常組織中APPL1的表達陽性率比較采用卡方檢驗，P＜0．05認為差異有統計學意義。APPL1在肺癌的表達與患者的年齡、性別、腫瘤分期、組織學類型的分析，采用秩和檢驗，P＜0．05認為差異有統計學意義。APPL1和EGFR在肺癌組織中的表達之間相關性的分析，采用 Spearman 秩和相關分析，P＜0．05， 有統計學意義。

2 結果

2.1 APPL1在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況 本實驗中50例肺癌組織中有35例呈不同程度的陽性表達，表達陽性率為70%(35/50)。而癌旁正常組織中APPL1陽性表達率為16%(8/50)，表達明顯低于肺癌組，肺癌組織與癌旁正常肺組織組之間陽性表達率差異比較具有統計學意義(P＜0．001)（見表 1）。

表1 肺癌組織與正常組織APPL1表達的比較

2.2 APPL1在肺癌組織中不同臨床病理特征的表達情況 組織學類型：陽性率：腺癌64%（16/25）；鱗癌76.19%(16/21)；小細胞癌75%(3/4)。3組樣本按不同的表達程度，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統計學意義。臨床分期：分別統計不同組織類型肺癌各臨床分期的APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統計學意義。性別：分別統計不同性別的肺癌組織中APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統計學意義。年齡：分別統計不同年齡（分＜60歲和＞=60歲兩組）的肺癌組織中APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，可見P值＞0.05，差異無統計學意義。（見表2）

2.3 APPL1與EGFR在肺癌組織中的表達情況的比較 分別統計肺癌組織中EGFR與APPL1的陽性表達，采用Spearman秩和相關分析相關性，結果見表中可見P值＜0.05（在置信度 （雙測）為0.05時，相關性是顯著的），差異有統計學意義，說明APPL1與EGFR在肺癌中的陽性率存在一致性，兩者在肺癌中的表達可能存在相關（見表3）。

3 討論

APPLl是近年發現的一種介導脂聯素信號轉導的調節蛋白。APPLl由709個氨基酸組成，基因定位于染色體3p14.3-p21.1，包含有22個外顯子和21個內含子，其全長45．6kb，包含氨基端的PH(Pleckstrin homology)結構域、BAR (Binamphiphysin-Rvs)結構域和羧基端的磷酸酪氨酸結合(PTB)結構域[4]。脂聯素水平的減少已經在多個疾病中觀察到，諸如2型糖尿病，肥胖的各種臨床疾病中觀測，胰島素抵抗[5，6]，心血管疾病[7]和高血壓[8]。

APPL1由BAR、PH以及PTB三個多功能結構域組成[9]，通過不同的結構域選擇性的與多膜受體、胞內信號分子相互作用，在細胞膜與細胞質之間進行著信號傳遞，參與細胞的生長、增殖和分化。

本研究結果表明APPL1在肺癌組織中的表達具有較高的陽性率，肺癌組織與癌旁正常肺組織組之間陽性表達率差異比較具有統計學意義(P＜0．001)，有望成為一種新的免疫標志物，或可應用于肺癌的臨床免疫組化診斷和鑒別診斷，或者成為一個新的治療靶點。本實驗研究了肺癌患者年齡、性別、組織學類型及臨床分期等臨床病理特點與APPL1的關系。結果表明APPL1與患者年齡、性別、臨床分期、無顯著相關性(P＞0．05)，而 APPL1 與EGFR在肺癌中的表達有相關性（P＜0.05）。

表2 APPL1在肺癌組織中不同臨床病理特征的表達比較

表3 肺癌APPL1與EGFR測定結果的比較

表皮生長因子受體(EGFR)家族被證實與許多腫瘤的發生、發展有著密切的關系，廣泛分布在人體各組織細胞膜上的一種多功能糖蛋白，是酪氨酸激酶信號通路上的一個重要分子。肺癌中EGFR有著較高的分布及表達已經得到了大量資料充分證實，之前就有研究顯示，45-85%非小細胞肺癌患者中存在EGFR的過度表達或者異常激活[10]。APPL1是EGF信號轉導途徑的下游效應因子，研究證實，在EGF的刺激下，APPL1調節EGFR的蛋白水平，APPL1的表達與EGFR的蛋白水平呈正相關[11]。Miaczynska M等實驗證實，APPL1和APPL2是Rab5的兩個新的效應體，接收EGF的信號，APPL1與Rab5的相互作用來調節細胞的增殖，APPL1與Rab在內吞運輸中的信號轉導中的作用具有至關重要的意義[12]。本實驗證實APPL1在肺癌組織中高表達，且同時與EGFR在肺癌組織中的表達相關，這或許能成為肺癌診斷及治療的新的切入點，提供新的思路。