前增菌時間對生禽肉中沙門菌檢驗的影響研究

◎ 朱應(yīng)飛，曾春華，吳 鑫，翟平平，范宏偉，姚小英

（1.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330000；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330000)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

鼠傷寒沙門菌（ATCC14028），購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器

42 ℃恒溫培養(yǎng)箱，36 ℃恒溫培養(yǎng)箱，拍擊式均質(zhì)器，電子天平。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；沙門菌顯色培養(yǎng)基，購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；56種沙門菌診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌計數(shù)

鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）純培養(yǎng)物的計數(shù)采用傾注PCA平板計數(shù)。用0.85%的生理鹽水將增菌液稀釋成10-6、10-7、10-83個稀釋度，每個稀釋度做2塊平皿，每塊平皿加1 mL稀釋液，傾注約20 mL溫度為48 ℃的PCA瓊脂，凝固后倒置36 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

前文詳細(xì)分析了換流器在發(fā)生不對稱故障時計及兩側(cè)諧波的實際觸發(fā)角和換相角計算原理，進而得到實際的熄弧角：

1.2.2 樣品采集

樣品采集時間為7月，分兩次進行，每次采集10份，樣品來自于各商場，每個商場每次采一份樣，均為生禽肉，采樣量約300 g，樣品采集后用冰袋冷藏運輸，3 h內(nèi)開始檢驗。

1.2.3 前增菌和增菌

無菌取25 g樣品分別加入到裝有225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min。同時隨機取一份樣品加入10-7的沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株稀釋液770 μL，均質(zhì)混勻作陽性對照。將樣品混合物于36 ℃恒溫培養(yǎng)，8 h后，搖勻，移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于42 ℃增菌培養(yǎng)24 h。同時移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36 ℃增菌培養(yǎng)24 h。8 h的前增菌液取樣后立刻放回培養(yǎng)箱繼續(xù)前增菌培養(yǎng)，前增菌18 h后，再搖勻，分別再取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL TTB和SC中，分別于42 ℃和36 ℃增菌培養(yǎng)24 h。

1.2.4 分離和鑒定

增菌24 h后，各管TTB和SC分別搖勻，用不銹鋼接種環(huán)劃線各接種一個BS平板和一個沙門菌顯色培養(yǎng)基平板，36 ℃培養(yǎng)。BS平板培養(yǎng)48 h，沙門菌顯色培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24 h。從BS平板上挑取黑色或棕褐色或灰色且菌落周圍呈黑色或棕色的可疑菌落，從沙門菌顯色培養(yǎng)基平板上挑取淡紫色可疑菌落，分別接種三糖鐵（TSI）、賴氨酸脫羧酶、尿素、氰化鉀、靛基質(zhì)、甘露醇、山梨醇和ONPG。對生化反應(yīng)陽性的可疑菌，從TSI轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂，做菌體抗原（O）鑒定和鞭毛抗原（H）鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌計數(shù)結(jié)果

沙門菌純培養(yǎng)稀釋到10-6、10-7、10-8后，計數(shù)結(jié)果分別為141 CFU/mL、13 CFU/mL、2 CFU/mL。

2.2 沙門菌的樣品檢驗結(jié)果

20份生禽肉樣品的沙門菌定性檢驗情況見表1。20份生禽肉中，總共檢出13份陽性，通過8 h前增菌檢出8份，通過18 h前增菌檢出9份，兩個前增菌時間同時檢出的有4份。

在分離平板上，雞肫67和雞丁76沙門菌呈優(yōu)勢生長。雞丁64、雞丁66和鴨肫80可疑平板上只有1～2個可疑菌落生長。雞丁68、雞丁70、雞肫71、雞丁72、雞丁74和鴨肫77可疑平板上有3～5個可疑菌落生長。雞肫69和雞丁78可疑平板上有6個及以上可疑菌落生長。分離平板上均有60～120個不等的單菌落生長。

表1 生禽肉中沙門菌檢驗結(jié)果表

3 討論

目前，國內(nèi)和國際上沙門菌的檢驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[2-3]依舊是以White-Kauffmann抗原表為基礎(chǔ)，依靠傳統(tǒng)的前增菌、增菌、分離、生化鑒定和血清鑒定。由于增菌分離的培養(yǎng)基種類和質(zhì)量的差異，樣品基質(zhì)復(fù)雜，尤其是樣品中雜菌菌相復(fù)雜，影響了目標(biāo)菌的檢出，傳統(tǒng)沙門菌檢驗面臨的最大技術(shù)問題是假陰性。如何提高樣品的陽性檢出率顯得尤為重要。

通過文獻檢索和多年對食品中沙門菌污染情況的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)生禽肉和生畜肉中沙門菌的污染最為嚴(yán)重，相應(yīng)的雜菌菌相復(fù)雜，生長旺盛，嚴(yán)重干擾了沙門菌的檢驗，極易造成假陰性，本研究選取生禽肉模擬雜菌菌相最為復(fù)雜、干擾最為嚴(yán)重的環(huán)境進行研究。雞丁68號樣品加入陽性對照菌，為保證能夠取到菌而又盡量少的加入，本試驗加入10-7標(biāo)準(zhǔn)株稀釋液770 μL，約等于10 CFU鼠傷寒沙門菌量。

本研究共檢測了20份樣品，8 h前增菌和18 h前增菌的檢出率分別為40%和45%，顯著高于我國餐飲食品中沙門菌的檢出率9.7%[4]，顯著高于合肥市屠宰生豬肉沙門菌的檢出率13%[5]，顯著高于美國食品安全檢驗署公布的2012年生畜肉及生禽肉產(chǎn)品中沙門菌檢出率（雞肉4.3%、豬肉1.3%、牛肉0.0%、嫩牛肉1.1%、絞牛肉1.9%、雞絞肉28%、火雞絞肉11%和火雞肉2.2%）[6]，可見南昌市生禽肉的沙門菌污染非常嚴(yán)重。本研究共檢出13份陽性，綜合檢出率為65%。張玲等[7]用美國農(nóng)業(yè)部的方法對長春市的市售雞胴體進行沙門菌監(jiān)測，7月份檢出率為100%，與之相較明顯偏低，提示按現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗，即使采用兩個前增菌時間，依然存在漏檢的可能。

本試驗中，有5份樣品在前增菌8 h未檢出，前增菌18 h后有檢出，表明在某些樣品中，前增菌8 h并不能夠充分復(fù)蘇和增殖目標(biāo)菌，過短的前增菌階段容易造成目標(biāo)沙門菌的丟失。另有4份樣品在前增菌8 h有檢出，前增菌18 h后未檢出。前增菌18 h后，理論上沙門菌能得以更充分復(fù)蘇和增殖，造成沙門菌反而丟失的原因是前增菌時間過長，使伴隨沙門菌的非目標(biāo)雜菌過度生長，競爭抑制甚至完全掩蓋了沙門菌的增殖。陽性對照菌鼠傷寒沙門菌在8 h前增菌有檢出，18 h前增菌后未有檢出，也是同樣的道理。

13份陽性樣品中，有兩份樣品，其分離平板上只有1～2個可疑菌落。在增菌液中目標(biāo)菌豐度低的情況下，從11 mL的增菌液中挑取5～20 μL進行劃線，分離出1～2個可疑菌落這個過程本身具有很大的偶然性。這提示本試驗檢定的7份陰性樣品中，有部分樣品很可能存在沙門菌，由于前増菌和增菌時的競爭抑制作用，造成目標(biāo)菌豐度低，接種環(huán)蘸取菌液時沒能蘸取到目標(biāo)菌，或者蘸取到少量的目標(biāo)菌，但由于與能夠在分離平板上良好生長的非目標(biāo)雜菌比例過于懸殊，沒能分離到目標(biāo)菌，實際上是假陰性。

分離平板的選擇效果是有限的，對于增菌液中目標(biāo)菌豐度低的樣品，劃線分離平板上單個菌落的數(shù)量成了試驗是否成功的另一關(guān)鍵，平板上的單個菌落越多，檢出目標(biāo)菌的可能性就越大，因此，在做分區(qū)劃線分離時，應(yīng)該盡量多地挑取菌液，第一區(qū)面積應(yīng)該盡量小，其他區(qū)域劃線在能夠分開的前提下，盡量密，不留空白，這樣才能最大限度地劃出盡量多的單個菌落，最大可能地分離出目標(biāo)菌。

有2份陽性樣品，其目標(biāo)菌在分離平板上呈優(yōu)勢生長，其他11份陽性樣品中沙門菌的生長遠(yuǎn)不如雜菌生長旺盛，前增菌液培養(yǎng)基中沒有加入任何抑菌成分，是雜菌生長最快的階段，需要在前增菌時間上做出適當(dāng)優(yōu)化，選擇一個最佳時間，在沙門菌充分復(fù)蘇，增殖數(shù)量與雜菌增殖數(shù)量之比最大時完成前增菌，效果最佳。

4 結(jié)論

由于無法事先準(zhǔn)確預(yù)知樣品中雜菌污染情況，因此無法確定最佳前增菌時間，同時采用兩個前增菌時間，可以大幅度提高檢出目標(biāo)菌的機會，同時，劃線分離的平板數(shù)量加倍，劃線分離的單個菌落數(shù)也會相應(yīng)的增加，對于豐度低的沙門菌樣品，可以大大提高其檢出率。樣品中目標(biāo)菌可能會出現(xiàn)前增菌8 h不夠充分復(fù)蘇和增殖，而前增菌18 h造成雜菌過度生長。建議采用3個前增菌時間8 h、13 h、18 h。這樣，在不至于增加太多的工作量的情況下，可以最大限度的提高目標(biāo)菌檢出率。樣品在前增菌8 h時，甚至在前增菌之初，雜菌已經(jīng)過度生長，目標(biāo)菌在前增菌的開始階段就被競爭抑制，按照現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)無法檢測到目標(biāo)菌，這就要求更好的選擇性增菌效果和更高效的分離培養(yǎng)基，如何對增菌和劃線分離進行優(yōu)化，還有待進一步研究。