小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜檢測(cè)與膠體金試紙法分析比較

◎ 欒振祥

（東?？h產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 東海 222300）

脫氧雪腐鐮刀菌俗稱嘔吐霉素（DON），是一種在小麥、玉米中常見的毒素，這種毒素對(duì)人體健康有較大的威脅，攝入這種毒素過(guò)多會(huì)導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法主要是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的液相色譜法以及快檢中的酶聯(lián)免疫法和膠體金檢測(cè)法。液相色譜法主要是儀器檢測(cè)，靈敏、準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫法和膠體金檢測(cè)法屬于定性和半定量的快速檢測(cè)方法，耗時(shí)較短，有利于批量篩選工作[1]。本文是通過(guò)高效液相色譜和膠體金試紙方法分別對(duì)小麥樣品中的DON進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的差別，從而為實(shí)驗(yàn)室人員提供參考，建立一種能夠快速發(fā)現(xiàn)、快速確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)室方法。

1 材料與方法

1.1 液相色譜法

1.1.1 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器，Waters公司）、高速均質(zhì)器（飛利浦公司）、玻璃纖維濾紙（英國(guó)Whatman公司）、6位空氣泵操作架（北京中檢維康公司）、電子天平（梅特勒公司）、氮吹儀（無(wú)錫沃信公司）、免疫親和柱（美國(guó)Vicam公司）。色譜純甲醇（中國(guó)國(guó)藥）、色譜純乙腈（中國(guó)國(guó)藥）、聚乙二醇PEG8000（美國(guó)Vicam公司）、超純水（美國(guó)Millipore公司）。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（純度大于99.5%）：200 μg/mL。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取0.1mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮?dú)鈨x吹干后，用流動(dòng)相（甲醇+乙腈+水=10+10+80）分別配制濃度為100、300、500、1 000、2 000、4 000 μg/L以及6 000 μg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.1.2 樣品凈化

玻璃注射器下連接免疫親和柱，準(zhǔn)確移取2 mL混勻的濾液于玻璃注射器中，連接空氣泵和玻璃注射器，調(diào)節(jié)空氣壓力，使溶液以每秒1～2滴的速度通過(guò)免疫親和柱，直至空氣完全進(jìn)入到免疫親和柱中。用5 mL高純水淋洗免疫親和柱，流速保持在每秒1～2滴，直至空氣完全通過(guò)免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.0 mL色譜純甲醇到玻璃注射器中，淋洗免疫親和柱并收集1.0 mL全部樣品洗脫液于玻璃測(cè)試管中。

1.1.3 提取液定容

將1.0mL洗脫液用氮?dú)鈨x吹干后，用300 μL流動(dòng)相（甲醇+乙腈+水=10+10+80）定容洗脫液，進(jìn)高效液相色譜儀分析測(cè)定。

1.1.4 儀器條件

色譜柱：Agilent C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水（V/V，10∶10∶80）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。

1.2 膠體金試紙檢測(cè)方法

1.2.1 儀器與試劑

HF6000便攜式試紙讀數(shù)儀（北京華安麥科公司）、干式加熱器（北京華安麥科公司）、移液槍（20～200 μL，100～1 000 μL，1～10 mL）、樣品提取液（純水）、嘔吐毒素快速測(cè)定試紙條（北京華安麥科公司）。

1.2.2 樣品處理

稱量5.0 g樣本，粉碎、加入離心管中，量取20 mL純水加入，加上塞子，振蕩1 min，靜置分層或4 000 r/min離心3 min得上清液，取2 000 μL樣品稀釋液，加入上清液50 μL，充分振蕩混勻后，待檢。若測(cè)試結(jié)果超出曲線范圍上限，需要再次檢測(cè)時(shí)，可取上述所得提取上清液，用樣品提取液（純水）對(duì)倍稀釋，再進(jìn)行同樣的以下操作。

1.2.3 樣品測(cè)試

①將快速測(cè)定試紙條、微孔試劑、待測(cè)樣品在室溫環(huán)境下放置20 min冷卻至室溫。②將微孔試劑放入加熱器中，調(diào)節(jié)溫度至40 ℃，5 min后取出試劑條待用。③移取待檢液200 μL于微孔中，充分混勻。④立刻將試紙條充分浸入微孔試劑中，計(jì)時(shí)5 min，取出試紙條在1 min內(nèi)檢測(cè)結(jié)果[2]。

2 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度比較分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)20份小麥樣本分別采用液相色譜法和膠體金檢測(cè)試紙法測(cè)定，將采用兩種試驗(yàn)方法得到的測(cè)定值進(jìn)行比較（液相色譜法測(cè)定結(jié)果作為參考），運(yùn)用公式：

通過(guò)計(jì)算精確度的范圍在85.4%～128.2%，平均101.2%。結(jié)果詳見表1。

表1 膠體金檢測(cè)試紙精確度檢測(cè)結(jié)果比較分析表

3 結(jié)論

本文以小麥作為分析對(duì)象，采用免疫親和高效液相色譜分析小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），研究DON在分析對(duì)象中的分布變化規(guī)律。該方法采用免疫親和柱凈化，以甲醇∶乙腈∶水=10∶10∶80（V/V/V）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量100 μL，方法檢出限為25 μg/kg。膠體金試紙方法檢出范圍0～4 000 μg/kg，對(duì)這些樣本用液相色譜法和膠體金檢測(cè)試紙法進(jìn)行測(cè)定，得到精確度的范圍在85.4%～128.2%，平均101.2%。在實(shí)驗(yàn)室的樣品檢驗(yàn)中可以通過(guò)膠體金檢測(cè)試紙法進(jìn)行篩選，對(duì)于超標(biāo)的可以再進(jìn)行高效液相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證，有利于提高實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)效率。