硫酸右旋糖酐抑制人胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用

高文衛 金秀 田潤玲 黃允寧 徐遠義

1寧夏醫科大學（銀川 750001）；2濟寧醫學院附屬醫院（山東濟寧 272029）；3寧夏寧安醫院（銀川750041）；4寧夏回族自治區人民醫院（銀川 750021）

胃癌的發病率和死亡率居于全世界的消化道腫瘤前列，并且呈年輕化趨勢［1-2］。化療藥物治療成為胃癌腹腔內種植轉移的主要治療手段，但到目前療效并不顯著。所以，目前亟待尋找新的有效治療胃癌腹膜種植轉移的抗癌藥物，并對其作用機制進行研究。

硫酸右旋糖酐（dextran sulfate，DS）是大分子右旋糖酐，分子量500 000。國外從1997年開始研究DS的抗癌作用，研究表明DS在腹腔內不易被吸收，且作用時間長，被認為是具有潛力的抗癌藥物［3］，但其具體機制尚不清楚。

LOX（銅-依賴性胺氧化酶）在低氧誘導的腫瘤轉移微環境中扮演著啟動開關的重要作用［4-5］。上調LOX表達，可促進癌細胞轉移［6］。

因此，本研究將通過人胃癌細胞AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細胞GES-1的體外培養及相關實驗，檢測DS對人胃癌細胞增殖、侵襲和遷移變化及DS對人胃癌細胞（BGC-823）LOX表達的影響。旨在明確DS對胃癌細胞轉移過程中增殖、侵襲、遷移的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1人胃癌細胞株本研究所用的人低分化胃腺癌細胞株（BGC-823）購自于北京金紫晶生物醫藥技術有限公司。高分化胃腺癌細胞株AGS、未分化胃腺癌細胞株MGC-803，中分化淋巴結轉移的胃腺癌細胞株SGC-7901及正常胃黏膜上皮細胞GES-1，均受贈于上海華東師范大學生命科學實驗室。

1.2實驗用藥品DS分子量約500 000，購自于美國Sigma公司。

1.3細胞培養將5種細胞培養于無菌恒溫培養箱37℃、5%CO2的完全培養基中，培養至對數生長期，傳代于60 mm培養皿中，于對照組及實驗組分別加入PBS及DS（終濃度為0.3%），不同時間后，收集細胞備檢，將部分BGC-823細胞放置于低氧培養箱，37 ℃，5%CO2，1%O2，培養不同時間后，收集細胞備檢。

1.4CCK8法檢測細胞的增殖調整細胞懸液密度為2.5×104個/mL，以 200 μL/孔 接種于 96 孔板，將6個96孔板置于培養箱中培養。待細胞貼壁穩定后，換液，實驗組加入含0.3%DS的培養液，對照組加入含等量PBS的培養液。0、6、12、24、36、48 h 后，每個孔內加入10 μL CCK8液，放回培養箱繼續培養4 h，酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度（OD）值，每組取5個復孔平均值。

1.5Transwell細胞侵襲實驗上室提前鋪Matrigel膠，待凝膠凝固后，調整細胞密度至1×105/mL，取細胞懸液200 μL加入上室，在24孔板下室，實驗組加入500 μL含FBS和3%DS的培養基，對照組加入含FBS和PBS的培養液，放入培養箱常規培養24 h。吸走上室內的舊培養液，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，將侵襲穿過膜的細胞進行固定和結晶紫染色，取5～10個視野進行細胞計數，取平均值。

1.6Transwell細胞遷移實驗調整細胞密度至1×105/mL。取細胞懸液200 μL加入上室，24孔板下室，實驗組加入500 μL含FBS和3%DS的培養基，對照組加入含FBS和PBS的培養液，放入培養箱常規培養24 h。吸走上室內的舊培養液，用棉簽擦去上室內的細胞，將遷移過膜的細胞進行固定和結晶紫染色，取5～10個視野進行細胞計數，取平均值。

1.7細胞免疫化學染色將細胞爬片4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，Triton 20 min，雙氧水15 min，封閉血清20 min，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，封固。LOX于細胞核表達，觀察陽性細胞分布特點及變化。應用IPP圖像自動分析系統，在400倍鏡下，選定空白區定標，選定具有代表性的5個視野，測定光密度值，并進行計算，以獲得所選視野的平均光密度值（optical density，OD）。

1.8Western-blot檢測LOX蛋白的表達將BGC823細胞培養至不同時間點，冰PBS沖洗3次，加入細胞裂解液，刮下皿底細胞，在冰上充分裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心機離心15 min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。等量蛋白（50～200 μg）上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%～10%），濕轉電泳轉移蛋白于硝酸纖維素膜上。10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，相應抗體4度孵育過夜。二抗孵育室溫1 h，ECL化學發光試劑顯色1 min，Amersham Imager 600儀器曝光。并使用Quantity one進行半定量檢測，目的/內參表示相應蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 CCK8檢測DS對5種細胞的增殖影響5種細胞共檢測了6個時間點，0、6、12、24、36、48 h，結果顯示，AGS細胞在24 h（P＜ 0.05，21.1%），36 h（P＜0.01，15.4%），48 h（P＜0.05，7.5%）實驗組細胞明顯比對照組減少，差異有統計學意義；SGC-7901細胞，直到 36 h（P＜ 0.05，20%），48 h（P＜0.05，19.5%）出現了DS抑制細胞增殖的顯著差異；BGC-823細胞，在36 h，DS明顯減小了細胞的數量（P＜0.05，18.8%）；MGC-803細胞和GES-1細胞，實驗組與對照組在0、6、12、24、36、48 h差異均無統計學意義（圖1）。

圖1 5種細胞CCK8檢測細胞增殖的統計折線圖Fig.1 CCK-8 assays to detect five kinds of cells proliferation

2.2Transwell細胞侵襲實驗檢測DS對5種細胞侵襲力的影響在Matrigel膠上接種5種細胞24 h后，胃癌細胞株BGC-823（P＜ 0.01）、MGC-803（P＜0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜細胞數明顯比GES-1多，且差異有統計學意義，而胃癌細胞株AGS與正常胃黏膜細胞GES-1的穿膜細胞數均比較少，兩者無明顯差別，對照組平均穿膜細胞數最多的胃癌細胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比對照組，實驗組DS明顯減少了5種細胞的穿膜細胞數，差異有統計學意義，且對BGC-823細胞（抑制率95%，P＜0.01）的侵襲抑制作用最明顯，其次是AGS（92.8%，P＜ 0.01）、MGC-803（90.1%，P＜ 0.01）、SGC-7901（87.8%，P＜ 0.01）、GES-1（72.3%，P＜ 0.01）（圖2）。

圖2 Tranwell侵襲和遷移實驗統計穿膜細胞數Fig.2 Tranwell cell invasion and migration assays detect invasion and transfer ability of these cells

2.3Transwell細胞遷移實驗檢測DS對5種細胞遷移力的影響在Transwell膜上生長24 h后，胃癌細胞株AGS（P＜ 0.05）、BGC-823（P＜ 0.05）、MGC-803（P＜ 0.01）、SGC-7901（P＜ 0.01）的穿膜細胞數均明顯比GES-1多，差異有統計學意義；對照組平均穿膜細胞數最多的胃癌細胞是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901、AGS；相比對照組，實驗組DS明顯減少了5種細胞的穿膜細胞數，差異有統計學意義，且對AGS細胞（抑制率96%，P＜0.01）的遷移抑制作用最明顯，其次是SGC-7901（94.1%，P＜ 0.01）、MGC-803（91.2%，P＜ 0.01）、BGC-823（90.5%，P＜ 0.01）、GES-1（84.3%，P＜0.01）（圖2）。

2.4免疫細胞化學檢測不同時間點LOX的表達隨著缺氧時間的延長，對照組LOX表達量呈增加的趨勢，實驗組DS能夠顯著降低LOX的表達水平。與對照組相比，結果差異存在統計學意義，2 h（P＞ 0.05），8 h（P＜ 0.05），12 h（P＜ 0.01），24 h（P＜ 0.01）（圖3）。

圖3 免疫細胞化學觀察BGC-823細胞不同時間點LOX的表達變化Fig.3 Immunocytochemistry detection of LOX expression at different time points

2.5Western blotting檢測LOX的蛋白表達在低氧條件下，對照組中LOX蛋白表達隨著時間的延長呈增加趨勢，而DS能夠顯著降低LOX表達量。與對照組相比，結果顯示部分差異具有統計學意義（8、12、24 h，P＜ 0.05；2 hP＞ 0.05）（圖4）。

圖4 Western blotting檢測LOX的蛋白表達Fig.4 Western blotting detecting LOX protein expression

3 討論

胃癌發生發展過程中極易發生侵襲和轉移，并且分化程度不同的瘤細胞可能有不同的增殖和侵襲遷移能力，因此如何防治和治療胃癌的增殖、侵襲和轉移是目前亟需解決的問題。

不同分化程度的瘤細胞可能有著不同的增殖能力。有體外研究表明DS可抑制癌細胞的細胞黏附性、細胞周期進展和基因表達［7］。本研究采用不同分化程度的人胃癌細胞株AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細胞株GES-1進行實驗，檢測DS對其增殖的影響。本研究通過CCK8增殖檢測結果顯示，在6、12 h DS對5種細胞的增殖均無明顯抑制作用；在24 h檢測出DS抑制AGS 21.1%；在36 h DS減少AGS 15.4%，SGC-7901 20%和BGC-823 18.8%，在48 h DS抑制AGS 7.5%和SGC-7901 19.5%，48 h內DS對MGC-803一直無明顯抑制作用，表明DS對高分化胃癌細胞AGS的增殖抑制作用最早，且最強，而DS對未分化胃癌細胞MGC-803無明顯增殖抑制作用。推測DS對胃癌細胞的增殖抑制作用可能與分化程度有關。

分化程度不同的瘤細胞具有不同的遷移能力。有研究證明，胃癌細胞BGC-823侵襲能力明顯強于胃癌細胞株AGS、SGC-7901及人胚胃上皮細胞 GES-1［8］。本研究 Transwell細胞遷移實驗結果顯示，AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901的穿膜細胞數明顯比GES-1多，可見這4種胃癌細胞的遷移能力都比正常胃黏膜細胞強。胃癌細胞中平均穿膜細胞數最多的是未分化胃癌細胞MGC-803，然后依次是低分化胃癌細胞BGC-823、中分化胃癌細胞SGC-7901、高分化胃癌細胞AGS，可見分化程度越低，穿膜細胞數越多，細胞遷移力越強；與對照組相比，DS明顯減少了實驗組5種細胞的穿膜細胞數，且對高分化胃癌細胞株AGS細胞的遷移抑制作用最明顯，其次是SGC-7901、MGC-803、BGC-823和正常胃黏膜細胞GES-1。由此推測，DS可能對5種細胞株的遷移能力均有抑制作用，并且與分化程度有關。

不同分化程度的瘤細胞具有不同的侵襲能力。本研究侵襲實驗結果顯示，胃癌細胞中平均穿膜細胞數最多的是MGC-803，然后依次是BGC-823、SGC-7901和AGS，可見分化程度越低穿膜細胞數越多，可能是因為細胞分化程度越低，其侵襲力越強，降解細胞外基質穿過基質膠的能力越強；相比對照組，DS明顯減少了實驗組5種細胞的穿膜細胞數，且對BGC-823細胞的侵襲抑制作用最明顯，其次是 AGS、MGC-803、SGC-7901、GES-1。本研究表明，DS對5種細胞侵襲過程的抑制強度順序與抑制遷移的順序不同，也與細胞分化程度無明顯關系。有研究表明［9］，腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶是降解基底膜和間質的主要成分，還有一種非蛋白酶依賴性的變形運動和膜泡運動的轉移方式。DS對5種細胞的侵襲和遷移的抑制強度順序不同，可能是因為缺氧環境下幾種細胞分泌基質金屬蛋白酶、降解細胞外基質的能力不同，并且DS可能對幾種細胞分泌的基質金屬蛋白酶有不同程度的抑制作用，具體抑制程度尚需要進一步研究。

課題組前期曾研究表明DS可以調節人胃癌細胞BGC-823 HIF-1α的蛋白表達，其可能會通過下調HIF-1α的表達從而抑制人胃癌細胞大網膜種植轉移［10］。而LOX被認為是受HIF調控的，是HIF-1的直接靶點之一，其在遷移和黏附的功能上需要缺氧誘導而發生［11］。LOX在低氧誘導的轉移過程中主要作用表現在細胞定位、細胞類型和轉化狀態，在腫瘤微環境中扮演著啟動開關轉移的重要作用［12］。研究證明，LOX活性是由氧含量進行調節的，并且LOX能夠調節細胞的遷移和黏附能力［13］。于是本研究進行了DS對胃癌細胞中LOX表達的影響。本實驗在低氧條件下表明，對照組LOX蛋白表達隨時間延長升高，實驗組應用DS后能顯著降低LOX表達水平，表明DS可能通過影響LOX表達抑制人胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，但其機制可能與HIF-1α有關系，還需進一步研究。