黃曲霉毒素B₁的檢測方法

徐榮 張佩華

摘要：目前研究進展顯示，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）是化學物質中致癌性最強的一種，對人和動物都會造成危害，本文旨在對黃曲霉毒素B1的毒性和檢測方法進行綜述。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1 毒性 檢測方法

黃曲霉毒素B1主要是由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物，是谷物污染中常見的具有強致癌性、致毒性、致畸性的真菌毒素，在生產中容易造成經濟損失、影響人畜健康，所以黃曲霉毒素B1的檢測方法在飼料生產和人類生活中具有重要意義。

1 黃曲霉毒素B1簡介

AFB1是含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）的二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，是目前已知化學致癌性最強的物質之一.可以通過儲存、加工等各種途徑污染糧油等農產品、食品和飼料等，直接或間接危害人類和動物的健康。

2 黃曲霉毒素B1的毒性

黃曲霉毒素B1的毒性要比嘔吐毒素的毒性強30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性強20倍。黃曲霉毒素B1的急性毒性是砒霜的68倍，氰化鉀的10倍，慢性毒性可誘發癌變，致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原發性肝癌也很可能與黃曲霉毒素有關。

當人類大量攝人AFB1時，可發生急性中毒，出現急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生;微量持續攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。AFB1具有致癌性，可導致人類肝癌和食道癌。

當動物家禽攝入AFB1時，采食量，體增重和飼料轉化率均會降低;還會導致不孕、流產、肺水腫、疫病易感性增加等現象發生。

3 黃曲霉毒素B1的檢測方法

世界各國及國際組織都制定了黃曲霉毒素B1的限量標準。GB 5009.22-2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中規定當稱取樣品5g時，柱前衍生法AFB，的檢出限為0.03μg/kg。目前，AFB1的檢測方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、微柱篩選法、微柱快速法、近紅外線分析儀測定法等。

3.1 薄層色譜法（TLC）

TLC法是測定黃曲霉毒素的經典方法，是中國測定食品及飼料中AFT黃曲霉素B1（AFBl）的標準方法之一（GB/T5009.23-2006）。其原理是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將AFB1從樣品中提取出來，經溶劑萃取純化，再在薄層板上層析展開，分離，利用AFB1的熒光特性，根據熒光斑點的大小和強弱，比較測定黃曲霉毒素含量。

TLC有單項展開法和雙向展開法，TLC法由于設備簡單，易于普及，所以國內外仍在使用，但由于該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想.提取液中雜質較多因而在展開時影響斑點的熒光強度，而雙向展開雖避免了雜質干擾，增加了靈敏度，但增加了操作步驟和時間。

3.2 液相色譜法

葉雪珠等（2003）用高效液相色譜法對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進行定量分析。其主要是用熒光檢測器檢測.在適宜的流動相條件下.采用反相C18柱，使多種黃曲霉毒素同時分離。黃曲霉毒素免疫親和柱HPLC法采用單克隆抗體免疫技術，可以特效地將黃曲霉毒素與其他真菌素中分離出來，分離效率和同收率高。此方法已得到廣泛應用，并被美國官方分析化學家協會（AOAC）確認為官方檢測方法。該方法的檢測限可達0.02—5ug/L。

郭金喜等（2017）研究結果表明，此方法影響測量AFB1結果不確定度的主要因素為樣品稱量、溶液體積、最小二乘法標準曲線擬合、樣品同收率等。所以在測試過程中可以從減小主要不確定度的來源進行改進，進而降低測量不確定度，使測試的準確率提高。

3.3 酶聯免疫法（ELISA）

酶聯免疫法檢測AFB1的理論基礎是抗原抗體反應，其采用單克隆或多克隆抗體技術，具有特異性強、分析時間短等優點。其原理是抗原（或抗體）吸附于載體上的免疫吸附劑和用酶標抗體（或抗原）與標本中的待測物（抗原或抗體）起特異的免疫學反應，最后用測定酶活力的方法來增加測定的敏感度。大體分為兩類：一是用雙抗體夾心法檢測樣本中的AFTB1，二是用競爭法檢測樣本中的AFTB1。為了使用方便，目前國內外已研制了酶標記免疫吸附測定試劑盒及配套儀器，此方法也被列入國家標準（GB/T5009.22 1996第二法）。

但由于ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，因此ELISA法測定結果穩定性較差，分析結果的準確性不高，容易出現假陽性結果。

柳其芳（2006）研究表明酶聯免疫吸附法是目前國際測定黃曲霉毒素B1的先進方法，靈敏度高，干擾少，測定步驟簡便、快速、操作安全。薄層色譜法中的確證試驗是利用三氟醋酸和黃曲霉毒素B1的特異性反應所生產的衍生物，確證黃曲霉毒素B1。結合國際先進酶聯免疫吸附法和傳統方法的優點，科學地實現了快速、可靠、準確測定黃曲霉毒素B1的目的。

張俊（2013）也研究表示薄層色譜法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量有操作繁瑣、使用化學試劑量大、對實驗人員健康危害大、定量差、耗時長等缺點。張俊個人建議推廣使用酶聯免疫吸附法測定糧食及其制品中黃曲霉毒素B1含量。

3.4 液相色譜串聯質譜法

一般來說，組織中黃曲霉毒素含量很低，而液相色譜串聯質譜法具有比高效色譜法更高的靈敏度和準確性，如今這種方法還極少使用在測定組織霉菌毒素含量中。該方法檢測限可達0.02～0.025 ug/L。84%甲醇水溶液提取樣品中，正己烷脫脂，HLB固相萃取柱凈化。采用電噴霧電離，正離子掃描，選擇多反應檢測模式（MRM）監測，外標法定量，該法靈敏，結果可靠。

甘盛等（2016）研究利用液相色譜一串聯質譜法對軟膠囊中藥用油輔料內黃曲霉毒素B1含量進行測定，結果表明此法靈敏準確，專屬性強，干擾少，重現性佳，對含油藥物制劑中黃曲霉毒素B1含量檢測有參考意義。

孫偉華等（2017）在基于分散固相萃取液相色譜一串聯質譜法測定大米中8種真菌毒素試驗中取得了成功并表示此方法實用、可靠，具有簡單、經濟、快速、準確等優點，可作為大米中真菌毒素的快速檢測方法。

4 小結

黃曲霉毒素B1容易污染飼料，對人畜健康會造成嚴重危害，容易造成經濟價值損失，目前各學者對黃曲毒素B1檢測方法仍在不斷研究，液相色譜法所需設備簡單，相對傳統，目前國內外仍在應用，但其存在耗時較長、操作繁瑣、使用化學試劑量大、對實驗人員健康危害大、定量差等不足之處;液相色譜法的準確率相對較高，目前也已廣泛應用：酶聯免疫法就目前來說比較先進，但是其也有缺點存在，比如酶的活性易受試驗條件影響，結果穩定性差，但總的來說其優點多于缺點，所以不少學者開始推薦使用酶聯免疫法測定黃曲霉毒素Bl在食品和飼料中的含量;液相色譜串聯質譜法目前使用較少，但其靈敏度和準確度相對較高，近年來也有關于此方法的研究，筆者認為，此方法在以后也會被廣泛推廣應用。

總的來說，每種方法都有其優、缺點，在日常生產中具體使用什么方法還是得具體針對其當前條件做出選擇。希望以后能找到更方便有效的檢測方法，達到快速和準確監控飼料中的黃曲霉毒素含量。

參考文獻（略）