MMP—9血清水平及啟動子C—1562T基因與缺血性腦卒中側(cè)支循環(huán)的關(guān)系

葉祖森　程建華　葉強(qiáng)等

[摘要]目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）血清水平及基因啟動子C-1562T多態(tài)性與缺血性腦卒中側(cè)支循環(huán)的關(guān)系。方法選取我院神經(jīng)科住院的急性缺血性腦卒中患者，收集患者一般臨床資料。側(cè)支循環(huán)的開放途徑分為三級，血流分級采用美國介入治療神經(jīng)放射學(xué)學(xué)會/介入放射學(xué)學(xué)會（ASITN/SIR）評估系統(tǒng)，采用ELISA法測定MMP-9血清水平，采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性（PCR-EFLP）測定MMP-9基因啟動子C-1562T位點C/T的基因多態(tài)性。結(jié)果共納入符合標(biāo)準(zhǔn)患者292例，其中男167例，女125例。年齡31～86歲，平均（61.43±10.07）歲。MMP-9血清水平及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)ASITN/SIR血流分級之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。不同側(cè)支循環(huán)途徑間MMP-9血清水平差異有統(tǒng)計學(xué)意3L（P<0.05）。Bonferroni校正后三級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平仍明顯高于一級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平和二級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論MMP-9血清水平可能對急性缺血性腦卒中患者腦側(cè)支循環(huán)代償途徑的預(yù)測有一定的作用，對患者個體化治療和預(yù)后的評價起到一定的指導(dǎo)作用。

[關(guān)鍵詞]腦卒中；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；側(cè)支循環(huán)；基因

中圖分類號：R743.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-816X（2018）03-0196-05

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2018.03.007

缺血性腦卒中作為嚴(yán)重危害我國人民健康的常見疾病，超早期血管再通是目前被證實有效的一種治療方法。腦側(cè)支循環(huán)是指當(dāng)大腦的供血動脈嚴(yán)重狹窄或閉塞時，血流通過其他血管（側(cè)支或新形成的血管吻合）到達(dá)缺血區(qū)，從而使缺血組織得到不同程度的灌注代償。它是決定急性缺血性腦卒中后最終梗死體積和缺血半暗帶的主要因素，對早期血管內(nèi)介入治療有一定的指導(dǎo)作用。側(cè)支循環(huán)的形成，尤其是三級側(cè)支循環(huán)，是血管新生的一個過程。基礎(chǔ)研究表明，血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在腫瘤血管生成及煙霧病側(cè)支循環(huán)形成過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于血清中MMP-9水平及MMP-9基因啟動子C-1562T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中側(cè)支循環(huán)之間的關(guān)系，尚未見相關(guān)報道。本研究旨在通過探討急性缺血性腦卒中患者血清MMP-9水平及MMP-9基因啟動子C-1562T基因多態(tài)性與腦側(cè)支循環(huán)的關(guān)系，尋找可能預(yù)測缺血性腦卒中顱內(nèi)血管側(cè)支循環(huán)的生物學(xué)指標(biāo)。

1資料與方法

1.1研究對象：選取2015年1月至2017年3月在我院神經(jīng)科住院的、發(fā)病至行數(shù)字減影血管造影（DSA）時間不超過7天的急性缺血性腦卒中患者212例，其中男167例，女125例，年齡31～86歲，平均（61.43±10.07）歲。收集患者一般臨床資料，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）全部人選缺血性腦卒中患者，均符合1996年第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦CT或MRI證實；（2）病灶位于前循環(huán)；（3）發(fā)病至行DSA檢查時間在1周之內(nèi)；（4）患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重肝腎功能不全患者，煙霧病、顱內(nèi)動靜脈畸形及腫瘤患者；（2）同時存在病灶對側(cè)大腦中動脈或?qū)?cè)頸內(nèi)動脈嚴(yán)重狹窄或閉塞的患者；（3）冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者；（4）拒絕參加本研究者。所有人選者均為中國南方地區(qū)的漢族人，彼此無血緣關(guān)系。本研究通過醫(yī)院倫理委員會倫理審核。

1.2方法：

1.2.1實驗方法：抽取入組者行DSA前約15分鐘內(nèi)的靜脈血各2個試管，每個試管2ml，一管以EDTA-Na2抗凝，用于基因組DNA抽提；另一管不加抗凝劑，分離血清后轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管內(nèi)，用于MMP-9含量檢測。兩者都保存于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

ELISA法測定血清MMP-9的含量，具體操作參照說明書。DNA的抽提：采用低滲溶血-酚/氯仿法從白細(xì)胞中抽提基因組DNA，適量滅菌雙蒸水溶解，核酸定量分析儀測定DNA濃度和A260/A280比值，將比值位于1.7～2.0之間者挑選作為PCR擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增MMP-9 C1562T位點及其側(cè)翼區(qū)：引物由上海基康公司合成，上游引物A：5-GCCTGGCACATAG-TAGGCCG3，下游引物B：5-CTFCCTAGCCAGC-CGGCATC-3，PCR反應(yīng)體系為10×緩沖液2.5μl，dNTP（各10mmol/L）0.5μl，上下游引物0.5μl+0.5μl（各20μmol/L），DNA模板0.1μg，TaqDNA聚合酶2U，加雙蒸水至總體積25μl。聚合敏鏈反應(yīng)PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，2min；變性94℃，45s；退火65℃，45s；延伸72℃，1min。共25個循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，吸取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析PCR產(chǎn)物特異性。酶切反應(yīng)：取經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物1μg，10×緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶NspI 2.5U，加雙蒸水至總體積20μl，置37℃水浴16個小時，終止酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。序列分析：對其中部分病例的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行切膠純化，于AB377型全自動測序儀上作DNA序列測定，驗證C1562T位點是否突變。

1.2.2 DSA檢查：使用荷蘭飛利浦公司生產(chǎn)的INTE-GRIS C/V血管機(jī)行數(shù)字減影主動脈弓及全腦血管造影。采用改良的Seldinger穿刺技術(shù)行右側(cè)股動脈穿刺，成功后置入5F動脈鞘。將5F的Pigtail導(dǎo)管置于主動脈弓，選歐乃派克作為造影劑，總量20ml，速度18ml/s.行主動脈弓造影。更換Pigtail導(dǎo)管，沿動脈鞘置入5F椎動脈造影管。分別置于雙側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、雙側(cè)鎖骨下動脈和雙側(cè)椎動脈，總量分別為8、7、6、6ml，速度分別為7、6、5、4ml/s。分別行上述血管正、側(cè)、斜、湯氏位DSA檢查。動態(tài)及靜態(tài)觀察造影血管的情況。

1.2.3側(cè)支循環(huán)的代償途徑及血流代償程度：腦側(cè)支循環(huán)代償分為三級側(cè)支循環(huán)途徑。一級側(cè)支循環(huán)指通過Willis環(huán)的血流代償。二級側(cè)支循環(huán)指通過眼動脈、軟腦膜吻合支以及其他相對較小的側(cè)支與側(cè)支吻合支之間實現(xiàn)的血流代償。三級側(cè)支循環(huán)屬于新生血管，部分病例在缺血后一段時間才可以形成。側(cè)支循環(huán)的血流代償程度采用ASITN/SIR血流分級系統(tǒng)，具體如下：0級：沒有側(cè)支血流到缺血區(qū)域；1級：緩慢的側(cè)支血流到缺血周邊區(qū)域，伴持續(xù)的灌注缺陷；2級：快速的側(cè)支血流到缺血周邊區(qū)域，伴持續(xù)的灌注缺陷，僅有部分到缺血區(qū)域；3級：靜脈晚期可見緩慢但是完全的血流到缺血區(qū)域；4級：通過逆行灌注血流快速而完全的灌注到整個缺血區(qū)域。快速指在2秒以內(nèi)充盈，緩慢指比對側(cè)充盈慢2秒以上。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20.0版軟件包處理。符合正態(tài)分布的計量資料采用（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，多組間比較采用方差分析；多組間的計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。不同側(cè)支循環(huán)組間的MMP-9水平采用箱式圖表示，MMP-9基因多態(tài)性及血清水平與側(cè)支循環(huán)灌注狀態(tài)的相關(guān)性采用多元Logistic回歸模型。校正因素包括性別、年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥、吸煙、MMP-9水平、基因型、心房顫動病史。為減少多重比較所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，采用Bonferroni校正法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MMP-9血清水平及其啟動子C-1562T多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)ASITN/SIR血流：分級的相關(guān)性：根據(jù)ASITN/SIR血流分級系統(tǒng)，將292例急性缺血性腦卒中患者分為5組，基于本研究中MMP-9基因啟動子C-1562T位點CC/CT/TT基因型分布為256例，34例和2例，故將CT基因型與TT基因型合并為一組，即CC基因型和CT+TT基因型。不同側(cè)枝循環(huán)血流分級組間一般臨床資料比較見表2。各組間一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MMP-9血清水平及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)ASITN/SIR血流分級之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

根據(jù)不同側(cè)支循環(huán)ASITN/SIR血流分級，將血流分級為0、1、2定義為灌注不良組，血流分級為3、4定義為灌注良好組。采用多因素Logistic回歸分析灌注良好組，灌注不良組間可能存在的差異因素。多因素分析校正因素包括性別、年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥、吸煙、MMP-9水平、基因型、心房顫動病史。MMP-9血清水平及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性與灌注程度間的差異見表3。多因素校正結(jié)果顯示，MMP-9血清水平（P>0.05）及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性（P>0.05）與灌注程度間不存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 MMP-9血清水平及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性與側(cè)支循環(huán)代償途徑的相關(guān)性：一級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平為（117.10±60.03）ng/ml，二級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平為（125.56±75.16）ng/ml，三級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平為（161.28±85.83）ng/ml，不同側(cè)支循環(huán)途徑間MMP-9血清水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.97，P<0.01），見圖1。三級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平明顯高于一級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平（t=3.57，P<0.01）和二級側(cè)支循環(huán)MMP-9血清水平（t=2.67，P<0.01）。為減少多重比較所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，再進(jìn)行Bonferroni校正。本研究中共進(jìn)行3次比較，故P值以0.05/3為標(biāo)準(zhǔn)。校正后不同側(cè)支循環(huán)途徑間MMP-9血清水平仍存在統(tǒng)計學(xué)差異。一級側(cè)支循環(huán)中，CC基因型占96例，CT+TT基因型占7例；二級側(cè)支循環(huán)中，CC基因型占125例，CT+TT基因型占20例；三級側(cè)支循環(huán)中，CC基因型占35例，CT+TT基因型占9例。不同側(cè)支循環(huán)途徑中基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

本研究從轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的角度，探討了MMP-9血清水平及MMP-9基因啟動子C-1562T多態(tài)性與缺血性腦卒中急性期顱內(nèi)側(cè)支循環(huán)的關(guān)系。結(jié)果提示我們MMP-9血清水平可能對急性缺血性腦卒中患者腦側(cè)支循環(huán)代償途徑的預(yù)測有一定的作用。

腦側(cè)支循環(huán)是決定急性缺血性卒中后最終梗死體積和缺血半暗帶的主要因素。腦側(cè)支循環(huán)代償一般通過三級側(cè)支循環(huán)途徑來建立。三級側(cè)支循環(huán)屬于新生血管，部分病例在缺血后一段時間才可以形成。在新生血管形成的過程中，需要內(nèi)皮細(xì)胞浸入周邊組織，這一過程需要兩種物質(zhì)參與。第一種是蛋白酶，其在細(xì)胞外基質(zhì)的降解及內(nèi)皮細(xì)胞在原有血管中的發(fā)芽發(fā)揮重要作用；另外一種是粘附分子，它們與一些結(jié)構(gòu)粘附并參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。細(xì)胞外基質(zhì)富有豐富的膠原蛋白，所以在血管新生的過程中，溶解膠原是一個非常重要的過程。MMP-9又稱明膠酶B，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，能降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的聚集和遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，參與血管反應(yīng)的病理生理過程以及神經(jīng)血管的再生和重塑。基礎(chǔ)研究表明，敲除老鼠MMP-9基因后，其血管新生能力明顯受損。血漿中MMP-9在腫瘤血管生成及煙霧病側(cè)支循環(huán)形成過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用。在腫瘤的新生血管生長過程中，血清MMP-9水平和血管內(nèi)皮生長因子成正相關(guān)。Huang等研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9通過調(diào)節(jié)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞，參與缺血組織中新生血管的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺血性腦卒中患者發(fā)病1周內(nèi)，血清MMP-9水平越高，三級側(cè)枝循環(huán)開放程度越大，而三級側(cè)枝循環(huán)正是新生血管形成的過程，結(jié)果與既往研究相符合。

MMP-9基因啟動子的-1562處存在有C→T的功能多態(tài)性，影響了基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生出低活性（C/C）和高活性（C/T、T/T）的啟動子基因型，導(dǎo)致MMP-9表達(dá)的增強(qiáng)或減弱。關(guān)于MMP-9基因啟動子C-1562T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中側(cè)支循環(huán)之間的關(guān)系，目前尚未見相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，MMP-9基因啟動子C-1562T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中側(cè)支循環(huán)不存在顯著相關(guān)性。本文推測可能主要有兩個原因：第一，本研究樣本量相對較少，尚需進(jìn)一步研究證實；第二，MMP-9血清水平在急性缺血性腦卒中急性期波動較大，MMP-9血清水平受多種因素影響。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中患者發(fā)病1周內(nèi)血清MMP-9水平與患者三級側(cè)支循環(huán)開放程度存在相關(guān)性。MMP-9血清水平對患者預(yù)后判斷及個體化治療可提供一定的參加價值。本研究結(jié)論尚需前瞻性研究加以證實。