氣相色譜-質譜法同時測定人體尿液中16種鄰苯二甲酸酯

張 力，雍 毅，黃 祥，侯 江，胡 穎，羅 利，吳 怡

(1. 四川省環境保護科學研究院，四川 成都 610041; 2. 四川省環境保護重金屬污染防治重點實驗室，四川 成都 610041;3. 四川大學華西第二醫院婦產科，四川 成都 610041)

0 引 言

鄰苯二甲酸酯（phthalate acid esters, PAEs），又稱酞酯、酞酸酯，常作為增塑劑和軟化劑應用到塑料工業，效果顯著而成本低廉[1]。同時，它也是一種環境激素類內分泌干擾化合物（endocrine disrupting chemical, EDC）[2]，會導致人體生殖功能障礙、發育行為障礙及其他與雌激素調解失衡的有關病癥[3-4]。

塑料是目前最通用、最受歡迎的材料，被各行各業廣泛的使用，極大便利了人們生活。但是，由于鄰苯二甲酸酯在材料中并沒有與材料以共價鍵結合，含鄰苯二甲酸酯的材料在生產、使用過程中和棄置后，鄰苯二甲酸酯均會源源不斷地釋放到周圍環境中，并通過生物富集作用、體表接觸和呼吸進入人體，從而影響人體內分泌系統，成為人們潛在的健康隱患[5]。歐洲化學品管理署（ECHA）2010年公布的第1份REACH法規“高關注物質名單”中共有16種高關注物質，其中有BBP、DBP和DIBP 3種鄰苯二甲酸酯類增塑劑[6]。美國則早在1977年就將6種鄰苯二甲酸酯類化合物列入重點控制污染物名單[7]。

本方法采用氣相色譜-質譜聯用技術結合液液萃取和高速離心分離的前處理方法，對某醫院采集的人尿中的16種鄰苯二甲酸酯進行了定量分析，為更精確、全面地評價鄰苯二甲酸酯在人體中的內暴露程度提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

1.1.1 實驗試劑

標準物質：16種鄰苯二甲酸酯混標（美國AccuStandard），純度不低于99.9%。色譜純正己烷購自德國CNW公司。

1.1.2 實驗儀器

美國 Thermo Fisher Scientific 公司 TRACE1310氣相色譜+ITQ700質譜聯用儀，帶AI/AS1310自動進樣器；KQ-500DE型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；N-EVAP-112氮吹儀（美國Organomation Associates）

1.2 樣品的預處理方法

本實驗采用液液萃取的方法對尿液樣品進行前處理。移取尿液4 mL于離心管中，加入0.4 g氯化鈉混勻，分別用1 mL正己烷提取3次，離心機4 000 r/min 離心 10 min，收集并合并正己烷層，用0.22 μm有機系PTFE濾頭過濾，40 ℃下氮吹至半干，正己烷定容至1 mL，進行GC-MS分析。

1.3 GC-MS測定條件

1.3.1 GC-MS 色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度 60 ℃，保持1 min，以 20 ℃/min 升溫至 220 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 4 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%）流量 1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

1.3.2 GC-MS 質譜條件

電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃；色譜與質譜接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：5 min；檢測方式：選擇離子掃描模式（SIM），監測離子見表1；外標法定量，用保留時間及特征離子定性、定量分析。

表1 16種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性離子及定量離子

2 結果與分析

2.1 16種鄰苯二甲酸酯的GC-MS分析

本方法使用HP-5MS毛細管柱，進樣溶劑為正己烷，進樣量不能大于2 μL，過大的進樣量會導致溶劑效應或使色譜柱過載，降低檢測效果，進樣量過小，方法靈敏度則達不到方法要求，故選擇1 μL為本方法進樣量；鄰苯二甲酸酯沸點較高，故進樣口溫度設置為250 ℃，使樣品在襯管中完全汽化，柱溫箱最高溫度和接口溫度設置為280 ℃，以保證色譜柱和接口潔凈無殘留。方法優化了氣相色譜柱溫箱升溫程序，降低了220～280 ℃的升溫速率，使性質相似、保留時間相近的峰分離良好。此色譜柱最佳載氣流量為1～2 mL/min，較低的流量可以增加峰分離度，故將載氣流量設置為1 mL/min。

為了提高檢測靈敏度和重現性[8-10]，避免樣品中其他組分的干擾，本方法采用選擇離子檢測的模式（SIM）。在選擇離子檢測模式下，質譜檢測器只檢測選定的特征離子，與全掃描模式相比，在相同的掃描模式周期內，選擇離子模式檢測每個離子的時間更多，檢測靈敏度提高了5～100倍[2]。使用16種鄰苯二甲酸酯混標在1.3條件下進行實驗，得到選擇離子模式（SIM）色譜圖，見圖1；16種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性離子及定量離子見表1。

圖1 16種鄰苯二甲酸酯的選擇離子檢測模式（SIM）色譜圖

2.2 樣品前處理方法的優化

PAEs是親脂性有機物，其辛醇-水分配系數較高，水溶性低，易溶于正己烷、二氯甲烷等大部分有機溶劑[11-12]。方法比較了正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯3種有機溶劑作為提取溶劑對PAEs的提取效率。結果表明，3種提取溶劑對水中PAEs的提取效果相近；3種溶劑中，正己烷非極性最強，萃取的雜質最少，同時，二氯甲烷毒性較強，乙酸乙酯揮發性較弱，而正己烷兼具低毒、易揮發的優點，故選擇正己烷作為樣品的提取溶劑。固相萃取等常用凈化手段凈化過程中萃取柱體、容器等的PAEs污染難以消除。同時，人體尿液樣品采集不易單個樣品體積小，輕微的污染將帶來巨大的誤差，故方法未對提取液進行凈化。

2.3 方法線性范圍、檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）

采用外標法對樣品進行定量分析，將16種鄰苯二甲酸酯混標母液用正己烷梯度稀釋成濃度為0.05，0.1，0.5，1，2，4 mg/L 的系列標準溶液；分別以各組分特征定量離子的峰面積Y對相應質量濃度X作線性回歸，得出線性方程及相關系數。從結果可以看出，16種鄰苯二甲酸酯在0.05～4 mg/L質量濃度范圍內均呈良好的線性關系，相關系數r2≥0.99。以3倍信噪比（S/N）確定方法檢出限（LOD）為 0.001～0.017 mg/L，10 倍信噪比（S/N）為定量下限（LOQ）0.002～0.056 mg/L，詳見表2。

2.4 實驗空白

鄰苯二甲酸酯廣泛存在于塑料制品和包括實驗室在內的各種環境中，故實驗中用到的所有器具均為玻璃制品，使用前將器具用正己烷潤洗，在通風廚晾干，以保證器具干凈。使用后實驗器具均用肥皂水擦洗，并在30 ℃下超聲10 min，自來水洗凈，再用超純水淋洗后在烘箱中以100 ℃烘烤2 h，以降低空白值。以生理鹽水作為空白尿樣按本方法處理并檢測，空白尿樣在鄰苯二甲酸酯對應保留時間處峰面積均小于標準曲線最低點該物質峰面積20%，DHXP定量離子m/z=149色譜圖如圖2所示。

2.5 方法準確度和精密度實驗

根據中國藥典（2015）通則9012《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，采用分析方法的準確度（重復性）描述該方法測得值與分析物標示濃度的接近程度（一般用加標回收率反映方法的準確度），精密度為測量值的相對標準偏差（變異系數）。本文用同一份均勻人體尿液樣本分別加入標準工作液配制高、低2個濃度級別的質量控制樣品，每個濃度級別8份樣品，按照前文所述方法對原樣和加標樣品進行檢測，得到加標回收率和相對標準偏差如表3所示。可以看出，除DIBP外，加標樣品8次測定的回收率在80%～120%之間，兩種濃度梯度下DIBP回收率均偏低，但高加標量回收率更高，可能是因為樣品未經過凈化，DIBP受到雜質干擾，導致回收率偏低，提高加標量時，進樣量和前處理程序一致，DIBP的量增加而雜質的量并沒有明顯變化，回收率得到提高；除低濃度級別樣品DMP、DEP、DIBP和 DBP外，RSD均低于 10%，方法精密度和準確度滿足分析要求。

表2 16種鄰苯二甲酸酯的方法線性方程、相關系數、線性范圍、LOD和LOQ

圖2 標準曲線最低點和空白尿樣DHXP定量離子m/z=149色譜圖

2.6 實際樣品的測定

收集了90份成都市某醫院人尿樣品，利用試驗建立的方法對其進行測定，扣除空白值后，DIBP、DBP和DEHP等10種鄰苯二甲酸酯均有檢出，其中DBP和DIBP檢出率高達77%和50%，DEHP檢出率也達到22%。表明成都市采樣人群中主要暴露的污染物為DBP、DIBP、DEHP和DNP。采樣人群尿液樣品PAEs含量范圍和檢出率見表4。

3 結束語

本文采用正己烷提取、氣相色譜-質譜（GC-MS）技術，建立了測定人尿中16種鄰苯二甲酸酯的分析方法。方法檢出限（LOD）為 0.001～0.017 mg/L，定量下限為 0.002～0.056 mg/L，除 DIBP 外，所有組分回收率在80%～120%之間；DMP、DEP、DIBP和DBP4種組分低濃度級別樣品RSD較高，其他組分高、低兩個濃度級別樣品RSD均小于10%。本方法前處理過程簡單方便、檢測靈敏度高、線性范圍寬，滿足人尿中鄰苯二甲酸酯的定性和定量檢測的需求，對鄰苯二甲酸酯在人體的內暴露評價有一定參考意義。

表3 16種鄰苯二甲酸酯的回收率與相對標準偏差

表4 成都市某醫院人尿樣品PAEs含量范圍和檢出率