硫化氫熒光探針研究進展

孫宗國，洪丹奇，謝振達，朱 勍

（浙江工業大學生物工程學院，浙江 杭州 310014）

0 引言

由于熒光生物成像具有靈敏度高、選擇性好、反應迅速、對細胞損傷小等優點，所以被廣泛應用于生物檢測技術中。在生物系統中，生理活性物質的特征包括低濃度，高反應性和短壽命。因此，精準地確定這些物種的細胞內濃度仍然是一個巨大的挑戰。為了迎合這些迫切需求，基于反應型熒光探針出現了[1]。

細胞內活性硫物質（RSS）是含硫生物分子的總稱，這些分子在生理和病理過程中起關鍵作用。谷胱甘肽（GSH）是最豐富的細胞內非蛋白質硫醇，可以控制細胞內的氧化還原活性，細胞內信號轉導和基因調控。半胱氨酸（Cys）牽涉到兒童生長緩慢，肝損傷，皮膚病變，以及肌肉和脂肪的損失。同型半胱氨酸（Hcy）是一種導致阿爾茨海默病和維生素B12的不足[2]。H2S已被確定為繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種氣體遞質。在生理水平，H2S調節細胞內氧化還原狀態和基本信號處理過程，包括監管血管緊張度，心肌收縮力，神經傳遞和胰島素分泌。細胞中H2S水平異常可以誘發許多疾病，如阿爾茨海默病，肝硬化，胃粘膜損傷以及動脈和肺部高血壓[3]。近年來，受益于H2S的化學反應，硫化氫熒光探針迅速增加。

1 基于硝基還原成氨基的熒光探針

含有硝基熒光團的探針設計存在一個主要障礙，主要因為硝基被認為是熒光團的強烈淬滅劑。然而，硝基在溫和的條件下可以被Na2S還原生成相應的氨基基團，這就為檢測H2S探針的設計合成提供了一種新方法。Wang等設計并合成了一種基于PET機制的熒光探針，此探針可以在HEPES緩沖液中用于胎牛血清中H2S的檢測[4]。七甲炔花菁類熒光探針通過硝基強吸電子作用產生PET效用，使熒光發生淬滅。另一方面，硝基被還原成氨基時，氨基是長孤電子對的強供電子基團，可能存在氨基到活性熒光團的受體激發PET過程。由于取代效應的存在，探針顯示出熒光發射的增加，以及量子產率從0.05增加到0.11。此探針被應用于RAW264.7細胞中的H2S的監測與跟蹤。

圖1 探針作用過程Figer 1 Probe process

2 基于硒亞砜還原成硒醚熒光探針

有機硒作為抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶的活性部位，可以調節細胞抗氧化防御系統，防止活性氧造成的損害，硒酶的氧化還原過程主要取決于硒化物之間的雙向機制。利用催化劑的模擬循環可以幫助開發熒光探針可逆檢測硫化氫[5]。由于硒亞砜和硒醚是吸電子基團和供電子基團，熒光探針可以通過PET或ICT順利進行。Han等人設計合成了可利用有機硒基團監測H2S和ROS之間的氧化還原循環的熒光探針，此可逆熒光探針可以檢測到H2S和HClO之間的氧化還原循環，該探針采用BODIPY熒光團作為信號傳感器和4-甲氧基苯基硒基苯作為調節劑[6]，該探針在BODIPY熒光團和4-甲氧基苯基硒基苯的PET作用下發生熒光淬滅效應，但是氧化后的硒阻止了PET，使熒光發生Trun-on。量子產率從0.13增加到0.96。該探針可用于RAW264-7細胞中的HClO和H2S監測。

圖2 探針作用過程Figer 2 Probe process

3 基于H2S親和反應的熒光探針

H2S是可以參與活體中親核反應的親和試劑，H2S的親和反應主要包括邁克爾加成反應、雙鍵加成反應、硫解反應。

3.1 基于邁克爾加成反應的H2S熒光探針

Qian等人報道了采用BODIPY作為熒光團的H2S熒光探針[7]，該探針的H2S識別基團由α，β不飽和甲基丙烯酸鹽和醛基組成，醛基可以可逆地與H2S反應形成半硫縮醛中間體，符合醛基與丙烯酸鹽的邁克爾加成反應。該探針由于PET效應使熒光淬滅，在與H2S反應后熒光發生Turn-on，該探針可用于HeLa細胞中的H2S檢測。

圖3 探針作用過程Figer 3 Probe process

3.2 基于雙鍵加成反應的H2S熒光探針

He等人設計了用于檢測H2S的比率熒光探針[8]，該探針可以認為是香豆素和花菁通過乙烯組成的混合熒光團，該探針得益于HS-與花菁在中性條件下的快速反應，在HS-后，H2S在生理條件下，加入假吲哚C-2原子，探針的π共軛被打破，消除花菁基團的發射，保留香豆素基團發射，熒光光譜發生位移。該探針可以在30 s和80 s時間內實現溶液中和細胞中H2S的快速檢測，且熒光強度增加了120倍。該探針已被應用與MCF-7細胞線粒體中H2S的檢測。

圖4 探針作用過程Figer 4 Probe process

3.3 基于硫解反應的H2S熒光探針

Lin等人合成了基于H2S檢測的硫解反應的近紅外熒光探針[9]，二硝基苯基團用于保護肽中的酪氨酸合成，硫醇在一定條件下可以去除二硝基苯基團。該探針由含有費舍爾醛的BODIPY與1-氟-2，4-二硝基苯合成，該探針由活性染料的強吸電子基團的d-PET過程，變現出無熒光。與H2S反應后，熒光團獲得釋放使熒光增加了18倍，檢測下限達到了10-8M。該探針可用于牛血清和MCF-7細胞中的H2S檢測。

圖5 探針作用過程Figer 5 Probe process

4 基于硫化酮沉淀的H2S熒光探針

與Cu（II）形成的金屬螯合物由于順磁性的Cu（II）可以接受熒光團的激發態電子，從而對熒光團有淬滅作用，當除去Cu2+時，熒光復蘇。這種熒光探針通常由熒光團-螯合劑-金屬離子組成。根據HSAB理論，S2-對Cu（II）具有很強的親和力，CuS沉淀相對穩定。當探針與H2S反應后，Cu（II）將從絡合物中消除，熒光探針再次釋放出熒光。Chang等人合成了一種檢測S2-的熒光探針[10]，探針是含有二吡啶胺的熒光素的Cu2+螯合物，該探針在水溶液中檢測限為420 nM。

圖6 探針作用過程Figer 6 Probe process

5 疊氮化物還原成胺型熒光探針

疊氮化物和其他氧化氮物種被硫化氫還原成胺的速度比GSH和其他硫醇快，是可以檢測硫化氫的。在硫化氫還原后，吸電子疊氮基團將被轉化為給電子氨基，因此，開發不同供電能力的取代基，導致多功能熒光探針被開發。

圖7 疊氮化物還原成胺型熒光探針總結Figer 7 Summary of strategies for fluorescent probes based on reducing azides to amines.

朱課題組研究了很多檢測硫化氫的熒光探針，在2018年，其課題組利用高效碳氫活化的方法，一步制備了全新的三氮唑喹啉類新型熒光染料[11]。此探針在8-氨基喹啉的基礎上，以5-三氮唑喹啉為發色團，通過引入疊氮基團，并在三氮唑基團上連接溶酶體靶向基團，成功構建了高選擇性的硫化氫熒光探針。此探針由于喹啉與疊氮基團之間存在PET作用，使探針具有熒光淬滅效果，在硫化氫存在時，PET效應被打破，熒光Turn-on。

6 結論與展望

圖8 探針作用過程Figer 8 Probe process

本文介紹了基于反應型H2S熒光探針的合成與作用原理。總之，探針的開發完善是一項具有挑戰性的任務，探針的開發解決了關鍵的生物問題。未來基于反應的熒光探針設計應注意內源性小分子必須處于正常生理條件下。同時探針在避免天然物種的干擾下（如谷胱甘肽，半胱氨酸），應對低濃度底物做出熒光變化，給出可靠的結果。所有這些都要求探針具有良好的選擇性，高靈敏度，良好的光穩定性，低細胞毒性，適宜的水溶性，以及在生理pH范圍內反應的能力。熒光探針在臨床診斷中的應用是最終目標。