一株深海來源放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究

王 鴻，周廣敏，華 熠

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

海洋微生物因處于獨(dú)特的高壓、高鹽、低溫等環(huán)境造就了其與陸地微生物不同的代謝途徑[1]，海洋來源的放線菌產(chǎn)生了許多具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，包括抗菌、抗腫瘤、細(xì)胞毒性、免疫抑制劑等，生長在未知或未開發(fā)環(huán)境中的放線菌，包括研究較少的海洋環(huán)境中的放線菌，成為開發(fā)新次級代謝產(chǎn)物的主要來源[2]。

本文針對一株分離自西南印度洋2945 m深的海洋沉積物中的稀有放線菌新菌株Amycolatopsis sp.WP1，進(jìn)行發(fā)酵，以抗菌活性追蹤為導(dǎo)向，對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

Amycolatapsis sp.WP1是采自西南印度洋深海洋沉積物中的稀有放線菌新菌株，由國家海洋局第三研究所張改云老師鑒定[3]，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCCNo.10738。

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus AB 2010021）、大腸桿菌（Escherichia coli AB 94012）、白色念珠菌（Candida albicans AY 204006）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis CMCC（B）63501）為浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

ISP2海水液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物4 g；麥芽提取物 10 g；葡萄糖4 g；海鹽 33 g；pH＝7.3，121 ℃，1×105Pa滅菌 20 min待用。

ISP2海水固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物4 g；麥芽提取物10 g；葡萄糖4 g；海鹽 33 g；瓊脂 15 g；pH＝7.3，121 ℃，1×105Pa滅菌 20 min 待用。

AM2 海水液體培養(yǎng)基（g/L）：大豆粉 10 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，可溶性淀粉5 g，酵母提取物 2 g，K2HPO40.5 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，pH＝7.4，121 ℃，1×105Pa滅菌 20 min待用。

1.2.2 菌株的發(fā)酵、萃取

菌株在ISP2海水固體培養(yǎng)基活化后，挑取適量的單菌落接種到ISP2海水液體培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d，該菌液作為發(fā)酵的種子液。

按照10%的接種量，將種子液接種到含有AM2海水液體培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在8000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上清液，用等體積乙酸乙酯萃取二次后，乙酸乙酯層濃縮至干，稱重。

1.2.3 粗提取物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定

利用小孔樹脂MCI對粗提取物進(jìn)行初步分離，以純水、純水-甲醇（4 ∶1）、純水-甲醇（3 ∶2）、純水-甲醇（2 ∶3）、純水-甲醇（1 ∶4）、純甲醇各 2個(gè)柱體積依次洗脫，收集各個(gè)梯度洗脫液。將洗脫液旋蒸、濃縮，純水段舍棄，獲得5個(gè)分段，分別為 A、C、B、D、E段。用 DMSO將分段溶解成50 mg/mL的樣品，備用。選用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌，革蘭氏陰性菌大腸桿菌，真菌白色念珠菌作為指示菌株，采用杯碟法檢測各個(gè)分段的抑菌活性[4]。

對5段進(jìn)行HPLC分離純化，在分析型色譜柱 Phenomenex（USA，Luna 5u C18）進(jìn)行條件摸索，后用半制備型色譜柱（Agilent XDB C18）進(jìn)行分離，最后用分析型色譜柱純化得到單體化合物，通過NMR分析，文獻(xiàn)對比，確定化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.4 單體化合物的體外抗菌MIC評價(jià)

DMSO溶解單體化合物使?jié)舛葹? mg/mL，備用。使用微量稀釋法對單體化合物進(jìn)行體外抗菌MIC評價(jià)[5]。將待測樣品加至96孔板中，利用新鮮培養(yǎng)基等倍稀釋成以下濃度梯度：100μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.5625 μg/mL、0.7825 μg/mL， 并加入指示菌菌懸液至100 mL。等體積的DMSO作陰性對照，等體積的氨芐青霉素鈉或兩性霉素B作陽性對照。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28℃下培養(yǎng)48 h后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以肉眼判斷無菌生長的最低濃度為MIC（μg/mL）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

Amycolatapsis sp.WP1菌株共發(fā)酵培養(yǎng)100 L，獲得粗提取物23.5 g。

2.1 粗提取物各分段的抗菌活性

抑菌實(shí)驗(yàn)效果結(jié)果如圖1所示，D段對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用，A、C、E段只對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，5段對白色念珠菌均沒有抑制作用。

圖1 各段的抗菌結(jié)果

2.2 單體化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)各段的不同，采用不同的分離條件，分離得到7個(gè)化合物，經(jīng)過NMR分析和文獻(xiàn)對比，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

圖2 化合物的結(jié)構(gòu)

化合物1：淡黃色晶體，可溶于甲醇，分子式C16H12O5，分子量 284。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.85 （3H， s）， 6.40 （1H， d， J=1.7）， 6.64（1H， d， J=1.65）， 6.82 （2H， d， J=1.65）， 7.37（2H，d，J=7.1），8.39 （1H， s），9.70 （1H，s），12.95 （1H， s）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6）：56.22， 92.53， 98.18， 105.54， 115.23， 121.16，122.65，130.29，154.50，157.58，157.65，161.85，165.37， 180.56。 與文獻(xiàn)[6]對比，確定為櫻黃素（4'，5-diidroxi-7-metoxiisoflavona）。

化合物2：淡黃色晶體，可溶于甲醇、乙腈，分子式 C13H14O5，分子量 250。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：2.35 （3H， s）， 3.40 （3H， s）， 3.90 （3H，s）， 4.55 （2H， s）， 6.04 （1H， s）， 6.37 （1H， s），13.02 （1H， s）；13C-NMR（125MHz，CDCl3）：20.63，56.35， 58.39， 61.77， 89.79， 105.26， 109.08，109.28，158.37， 160.74，164.39，166.82，182.63。與文獻(xiàn)[7]對比，確定為6-甲氧基甲基丁香酚（6-methoxymethyleugenin）。

化合物3：淡黃色晶體，可溶于甲醇，分子式C15H10O4，分子量254。淡黃色晶體，可溶于甲醇，分子式C15H10O5，分子量270。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6）：6.80 （2H， d， J=8.6）， 6.86 （1H， d，J=2.25）， 6.93 （1H， dd， J=2.2， 8.7）， 7.37（2H， d， J=8.8）， 7.96 （1H， d， J=8.8）， 8.29（1H， s）， 9.53 （1H， s），10.76 （1H， s）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：102.09， 114.94， 115.13，116.62， 122.53， 123.47， 127.30， 130.08， 152.84，157.17，157.43，165.52， 174.69。與文獻(xiàn)[8]對比，確定為 4'， 7-二羥基異黃酮 （Daidzein， 4'， 7-Dihydroxyisoflavone）。

化合物4：淡黃色晶體，可溶于甲醇，分子式C15H10O5，分子量270。淡黃色晶體，可溶于甲醇，分子式C15H10O5， 分子量270。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6）：6.23 （1H， d， J=2.1）， 6.39 （1H， d，J=2.1）， 6.82 （2H， d， J=8.65）， 7.37 （2H， d，J=8.65）， 8.33， （1H， s）， 9.61 （1H，s），10.87（1H， bs）， 12.96 （1H， s）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6）：93.64，98.95，104.44，115.03，121.18，122.26， 130.13， 153.96， 157.39， 158.58， 161.98，164.27，180.19。 與文獻(xiàn)[9]對比，確定為 4'，5，7-三羥 基 異 黃 酮 （Genistein， 4'，5，7-trihydroxyisoflavone）。

化合物5：白色針晶，可溶于甲醇，分子式C21H20O9，分子量 416。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.16-3.72 （6H，m）， 5.08 （1H，m）， 6.81（2H， d， J=8.6）， 7.14 （1H， dd， J=2.25， 8.85），7.23 （1H， d， J=2.25）， 7.41 （2H， d， J=8.55），8.04 （1H， d， J=8.9）， 8.39 （1H， s）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：60.63， 69.62， 73.12，76.47， 77.21， 99.97， 103.37， 114.97， 115.58，118.46， 122.30， 123.69， 126.95， 130.08， 153.69，157.03，157.26，161.39， 178.74。與文獻(xiàn)[9]對比，確定為大豆苷，即4’，7-二羥基異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖 （4'，7-hydroxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物6：白色針晶，可溶于甲醇，分子式C23H22O10，分子量 458。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.74-4.45 （6H， m），5.16 （1H，d，J=7.35），6.82 （2H，d，J=8.6），7.13 （1H，dd，J=2.35，8.9），7.22 （1H，d，J=2.3），7.40 （2H，d，J=8.65）， 8.05 （1H， d， J=8.9）， 8.39 （1H， s）；13CNMR（125 MHz，DMSO-d6）：20.67， 63.09， 69.80，73.06， 73.81， 76.26， 99.65， 103.48， 115.02，115.49， 118.55， 122.27， 123.76， 127.00， 130.10，153.42， 157.02， 157.33， 161.15， 170.27， 174.79。與文獻(xiàn)[10]對比，確定為 6″-乙酰基-大豆苷（6″-O-acetylgenistin）。

化合物7：白色針晶，可溶于甲醇，分子式C22H22O10，分子量 446。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：3.88 （3H，s），4.61 （1H， t）， 5.15 （1H， d，J=4.95）， 5.43 （1H， d， J=2.7）， 5.17 （2H， d， J=7.15）， 5.43 （1H， d， J=2.7）， 6.81 （2H， d， J=8.6）， 7.32 （1H， s），7.40 （2H，d， J=8.6），7.48 （1H， s），8.38 （1H，s）， 9.57 （1H，s）；13CNMR（125 MHz，DMSO-d6）：55.83， 60.62， 69.57，73.02， 76.76， 77.21， 99.61， 103.42， 104.72，114.99， 117.81， 122.59， 123.13， 130.08， 131.54，147.46，151.54，153.06，157.21， 174.39。 與文獻(xiàn)[11]對比，確定為黃豆黃苷（Glycitin）。

2.3 單體化合物的MIC

選用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、枯草芽胞桿菌作為指示菌株，采用微量稀釋法對化合物進(jìn)行體外抗菌活性MIC評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7個(gè)化合物對四株指示菌都沒有較好的活性（MIC＞100 μg/mL）

2.4 討論

粗提取物具有抗菌活性，但最終沒有分離得到具有抗菌活性的化合物，分析原因：分離過程中，多使用紫外檢測器對化合物進(jìn)行分離，有些具有活性的化合物沒有較好的紫外吸收，或所選用的波長不是該活性化合物最大吸收波長，因而在純化過程總可能被忽略舍棄；粗提物和各段中的多種化合物之間產(chǎn)生的抑菌作用協(xié)同、相加，表現(xiàn)出明顯的透明圈，而單個(gè)化合物可能產(chǎn)生的抑菌效果較弱；由于分離手段和分離經(jīng)驗(yàn)不足，使得具有良好抑菌效果的化合物沒有分離到。

3 結(jié)論

對一株深海來源的放線菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取，得到粗提取物，以抗菌活性追蹤為導(dǎo)向，將粗提取物初步分離為5段，并對這5段進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，其中有4段對金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌活性，有1段對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌都有很好的抑菌作用。進(jìn)一步的分離，得到7個(gè)已知化合物，分別是櫻黃素（1），6-甲氧基甲基丁香酚（2），4'， 7-二羥基異黃酮（3），4'，5，7-三羥基異黃酮（4），大豆苷（5），6″-乙酰基-大豆苷（6），黃豆黃苷（7），這 7個(gè)化合物均是首次在這株菌中分離得到。對這7個(gè)化合物做了抗菌活性評價(jià)，MIC結(jié)果顯示，7個(gè)化合物都沒有較好的抗菌活性 （MIC＞100μg/mL）。雖然這些化合物沒有顯示出較好的抗菌活性，但是生物活性導(dǎo)向仍然是活性化合物分離的重要方式。如何有效快速地分離得到具有生物活性的化合物，是微生物次級代謝產(chǎn)物的重點(diǎn)和難點(diǎn)，加強(qiáng)海洋來源微生物的研究依然是重要和有意義的。