安立生坦對低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

宋 強(qiáng)，胡 志，王 軍，范粉靈，王宇星，張玉順

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，陜西 西安 710061；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710061)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH) 是臨床眾多心肺疾病發(fā)展過程中的重要改變，以低氧性肺血管收縮(HPV) 和低氧性肺血管重建(HPSR) 為其主要的病理生理特征[1]。其中平滑肌細(xì)胞增殖引起的低氧性肺血管重建是藥物治療不佳的主要原因，如何減輕及逆轉(zhuǎn)血管的重構(gòu)成為治療HPH 的關(guān)鍵[2]。安立生坦(ambrisentan)是一種高選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑，口服不僅能夠降低肺動脈壓力，而且對肝損害較小。為臨床肺高壓治療藥物中的新星[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道安立生坦在特發(fā)性肺動脈高壓和硬皮病相關(guān)性PAH中治療中的持續(xù)作用[4]，但關(guān)于HPH作用罕有報(bào)道。本研究通過建立HPH大鼠模型，給予安立生坦干預(yù)，觀察其對肺動脈高壓大鼠肺血管平滑肌增殖與凋亡的影響，進(jìn)而探討其治療肺動脈高壓的可能分子機(jī)制，并為臨床上使用高選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑是否改善肺血管重塑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)時(shí)間2016年4～8月，健康成年雄性SD大鼠40只，體重200～250 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。安立生坦(H20130365 Ambrisentan 凡瑞克)為葛蘭素史克公司產(chǎn)品，兔抗大鼠Bcl-2，Caspase-3多克隆抗體和β-Actin抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，SP免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，全自動調(diào)節(jié)低壓低氧倉由第四軍醫(yī)大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供，RM-6200多道智能生理信號記錄系統(tǒng)為成都儀器廠產(chǎn)品。

1.2模型建立在40只SD大鼠中隨機(jī)選30只大鼠于低壓低氧艙中飼養(yǎng)2周，8 h/d，再隨機(jī)分為模型組、藥物治療組、安慰劑組各10只。HPH動物模型的建立采用李娟等[4]報(bào)道的方法。從第3周起，模型組繼續(xù)在艙中飼養(yǎng)，藥物治療組大鼠每天進(jìn)艙前給予凡瑞克5 mg/kg灌胃，安慰劑組大鼠于進(jìn)艙前給予生理鹽水2 ml灌胃；至第4周結(jié)束為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，剩余10只作為對照組，正常環(huán)境中飼養(yǎng)4周。

1.3肺血流動力學(xué)測定實(shí)驗(yàn)滿4周后，按Pei[5]等報(bào)道的方法，自大鼠右頸外靜脈插入聚乙烯塑料管，導(dǎo)管另一端與微型壓力傳感器相連，導(dǎo)管進(jìn)入肺動脈干。采集、記錄及分析指標(biāo)大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)，計(jì)算右心肥厚指數(shù)RV/(LV+S)。

1.4肺小動脈形態(tài)學(xué)分析在400倍光鏡下觀察并拍片，每張切片連續(xù)觀察肺組織中型肺動脈或小型肺動脈，應(yīng)用Nikon &Spot 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測：RMT為T(肺理想血管中膜厚度)與R(外彈力層包繞的理想血管半徑)之比，T為R與r(內(nèi)彈力層包繞的理想血管半徑)之差。每只大鼠測5～10個(gè)，求其均值。

1.5肺動脈Bcl-2免疫組織化學(xué)染色法將肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，孵育、修復(fù)抗原、恒溫箱中封閉1 h后，依次滴加一抗即Bcl-2多克隆抗體(1：200)，Caspase-3多克隆抗體(1：300)、生物素化的羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，最后經(jīng)顯色及復(fù)染。采用Motic醫(yī)學(xué)圖像采集和分析系統(tǒng)，對Bcl-2和 Caspase-3的定位及表達(dá)進(jìn)行分析，放大倍數(shù)×400，隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)測得平均灰度。

1.6Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)定量測定常規(guī)提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉60 min。加入一抗(Bcl-2：1：500；Caspase-3：1：800)，β-αctin：1：8000)，4℃過夜。加入酶標(biāo)記二抗(1：8000)，37℃孵育1小時(shí)。發(fā)光劑曝光并拍照記錄。以Quantity One成像分析系統(tǒng)進(jìn)行WB條帶的灰度值分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，不符合進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HAEPH模型的確認(rèn)大鼠血流動力學(xué)、右心室肥厚的指標(biāo)模型組mPAP、RVSP明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藥物治療組mPAP、RVSP較模型組、安慰劑組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物治療組與對照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 各組大鼠對HPH大鼠血流動力學(xué)的影響的比較(n=10)

a與對照組比較，P< 0.05；b與模型組比較，P< 0.05；c與安慰劑組比較，P< 0.05

2.2肺動脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化對照組大鼠動脈內(nèi)膜完整光滑、管壁薄、管腔大、肌層無增厚(圖 1)；模型組與安慰劑組大鼠出現(xiàn)肺動脈中層增厚、細(xì)動脈肌型化、血管內(nèi)膜細(xì)胞增殖及管腔變窄等肺血管重構(gòu)的變化。而藥物治療組大鼠肺動脈的管壁厚度、管腔大小恢復(fù)至對照組的狀態(tài)，表明肺動脈重構(gòu)得到抑制及逆轉(zhuǎn)。與模型組和安慰劑組比較，藥物治療組HPH大鼠管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)、肺血管管壁厚度占外徑的百分比(WT%)均顯著降低(P< 0.05)；與對照組比較，模型組和安慰劑組HPH大鼠WA%、WT%均顯著增高(P< 0.05)，藥物治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠肺小動脈形態(tài)學(xué)變化的觀察 (HE染色，×400) A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D對照組

表2 各組大鼠WA%和WT%的比較(n=10)

a與對照組比較，P< 0.05；b與模型組比較，P< 0.05；c與安慰劑組比較，P< 0.05

2.3大鼠肺動脈Bcl-2蛋白的表達(dá)與對照組相比，模型組大鼠肺組織Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著增加(P< 0.05)；與模型組相比，藥物治療組 Bcl-2的表達(dá)量減少(P< 0.05)；藥物治療組肺動脈平滑肌Bcl-2與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2，圖3，表3。

圖2 各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白分布和表達(dá)的免疫組化染色檢測(免疫組化染色，×400) A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組

圖3 各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量的比較 A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組。與對照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與安慰劑組比較，cP < 0.05

表3 各組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)(n=10)

與對照組比較，aP< 0.05；與模型組比較，bP< 0.05；與安慰劑組比較，cP< 0.05。

2.4大鼠肺動脈中Caspase-3蛋白表達(dá)免疫組化染色法及Western Blot結(jié)果均顯示與對照組相比，模型組肺動脈平滑肌中Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P< 0.05)；與模型組相比，藥物治療組肺動脈平滑肌Caspase-3的表達(dá)顯著升高(P< 0.05)；藥物治療組肺動脈平滑肌Caspase-3與對照組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，圖5，表4。

圖4 各組大鼠肺組織中Caspase-3蛋白分布和表達(dá)的免疫組化染色檢測(免疫組化染色，×400) a：模型組；b：藥物治療組；c：安慰劑組；d： 對照組

圖5 各組大鼠肺組織中Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量的比較 A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組。與對照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與安慰劑組比較，cP < 0.05

表4 各組大鼠肺組織Caspase-3的表達(dá)(n=10)

與對照組比較，aP< 0.05；與模型組比較，cP< 0.05；與安慰劑組比較，eP< 0.05

3 討論

HPH是高原地區(qū)中的一種常見病、多發(fā)病，是以肺動脈壓力升高、低氧血癥為主要特征，其中肺血管重塑是HPH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長期低氧條件時(shí)，肺動脈平滑肌細(xì)胞生長調(diào)控失衡，引發(fā)細(xì)胞的異常增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，最終促進(jìn)肺血管重塑的發(fā)生[6]。

在本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，模型組與安慰劑組SD大鼠的mPAP、RVSP、dP/dtmax及RV/(LV+S)均明顯高于對照組，提示HPH大鼠模型的構(gòu)建成功。而藥物治療組大鼠的上述指標(biāo)均明顯低于模型組和安慰劑組大鼠，表明凡瑞克作為ETAR的拮抗劑，能有效地降低HPH大鼠模型肺動脈壓力。肺血管HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組與安慰劑組大鼠的肺血管的中層增厚，細(xì)動脈肌型化，肺血管內(nèi)膜細(xì)胞增殖，血管腔明顯狹窄，WT%、WA%明顯增高；而藥物治療組的大鼠上述指標(biāo)顯著改善，提示凡瑞克可有效逆轉(zhuǎn)HPH中肺血管重塑的作用。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的相互作用是影響血管組織重塑的重要因素。正常情況下二者處于相對動態(tài)平衡以維持組織的正常形態(tài)。當(dāng)機(jī)體處在缺氧、毒素等情況下上述平衡被打破，細(xì)胞增殖的數(shù)量超過細(xì)胞凋亡的數(shù)量時(shí)就可能出現(xiàn)組織重塑。細(xì)胞的凋亡是受基因控制的，Bcl-2作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的凋亡。Caspase-3是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)大、最終效應(yīng)因子，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶[7，8]。Bcl-2通過抑制細(xì)胞線粒體PT通道的開放(即線粒體膜電位下降)，從而阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放進(jìn)而抑制Caspase-3的激活，最終達(dá)到阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，于此同時(shí)Bcl-2亦能直接抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放從而減少Caspase-3的激活[9～11]。在該實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，模型組Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著增高，而Caspase-3的蛋白表達(dá)顯著降低，提示Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)失衡共同參與了HPH的發(fā)生及發(fā)展。與模型組相比，藥物治療組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Caspase-3蛋白表達(dá)升高，肺血管厚度及管腔大小得到顯著改善，肺血管重塑減輕。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示凡瑞克抑制肺血管平滑肌增殖、促進(jìn)其凋亡可能與通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，從而改變Bcl-2/bax的比例，增加細(xì)胞對凋亡信號的易感性，最終肺血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[12～14]。據(jù)此，我們推測凡瑞克對HPH動物模型肺血管重塑的抑制作用，可能通過抑制Bcl-2，直接和間接兩個(gè)方面激活Caspase-3蛋白，誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡[15～19]。

綜上，凡瑞克可能是通過抑制低氧SD大鼠肺動脈中Bcl-2的合成、促進(jìn)Caspase-3的生成，激活凋亡通路，逆轉(zhuǎn)肺血管的重塑，進(jìn)而達(dá)到治療肺動脈高壓的作用。然而，仍需更多研究進(jìn)一步明確凡瑞克在治療肺動脈高壓中的相關(guān)分子機(jī)制。