WISP-1對單側輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化的作用研究

鐘 翔，楊 雪，2，涂月菊，李 怡，張 萍，鄒玉蓉，李貴森，王 莉

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎內科，四川 成都 610072；2.西南醫科大學，四川 瀘州 646000)

腎纖維化是各種慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進展至終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的共同表現，是影響患者腎功能和腎臟預后的主要指標。目前臨床實踐中仍然缺乏有效的腎臟纖維化干預措施。WNT1誘導信號通路蛋白1(WNT1-inducible signaling pathway protein-1，WISP-1)也稱為CCN4，是一種富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽。研究證實，WISP-1通過增強細胞粘附、促進細胞遷移和刺激細胞增殖等方法[1，2]，參與肺臟[3]，心臟[4]和肝臟[5]等器官的纖維化，但它在腎臟纖維化中的具體作用仍然未知。因此，本研究旨在探討WISP-1在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎臟纖維化中的作用，為腎纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1動物模型制備與干預2015年9月至2017年6月體重20～25 g的雄性C57BL/6清潔小鼠(10周)購自四川省人民醫院實驗動物中心。首先參考課題組以前實驗方法制作UUO模型[6]。將5 μg的小鼠WISP-1/CCN4親和純化多克隆抗體(Pab)(AF1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)和5 μg的小鼠WISP-1/CCN4單克隆抗體(Mab)(MAB1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)通過腹腔注射到UUO小鼠作為處理組(UUO+Ab)；同時將純化大鼠IgG(6-001-A，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)注射入UUO小鼠腹腔作為對照組處理組(UUO+IgG)；單純行UUO手術小鼠作為模型組(UUO)；隨機選擇年齡體重匹配正常小鼠作為正常組(Normal)；每組均為10只。將所有小鼠飼養于控制環境條件下(23 ℃)具有12小時明暗周期的房間中，在UUO手術后第7天麻醉處死所有小鼠并收集梗阻側腎組織。該實驗經四川省人民醫院醫學倫理委員會批準(倫理編號：2013自科(04)號)。

1.2腎臟病理和免疫組織化學染色在UUO手術后第7天處死小鼠后，取出梗阻側腎臟并用4%多聚甲醛固定，然后包埋在石蠟中。制備3 μm的腎臟切片，并使用蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色，高碘酸-雪弗(periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson三色染色評估腎臟病理學變化。免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色在常規脫蠟水化后，使用高溫高壓進行抗原修復。一抗包括抗WISP-1 (ab178547，Abcam，劍橋，英國)、抗膠原蛋白I(抗 Collagen I，ab34710，Abcam，劍橋，英國)4 ℃過夜后，室溫孵育二抗1小時，使用DAB進行顯色，顯微鏡下控制顯色時間。靶蛋白的陽性染色區域使用ImageJ軟件(NIH)測量，結果表示為檢測區域的百分比。

1.3蛋白質免疫印跡分析在液氮中研磨小鼠腎臟組織后，使用RIPA緩沖液在冰上裂解組織，超聲后13000×g 10分鐘離心提取上清液。蛋白樣品電泳后，將蛋白轉移至PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1小時。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下二抗孵育2小時。ECL試劑顯影，并用Image Quant LAS4000微型系統捕獲。使用ImageJ軟件定量分析蛋白質印跡的變化。

1.4統計學方法采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。計量資料比較采用單因素方差分析及SNK法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1常規病理染色顯示抗WISP-1治療改善UUO小鼠腎組織纖維化的形態學改變常規病理染色包括HE，PAS和Masson三色染色顯示對比正常小鼠組，UUO組和UUO + IgG組小鼠腎組織出現不同程度腎間質纖維化、腎小球硬化和膠原纖維及細胞外基質沉積，表明造模成功。在WISP-1抗體干預后，UUO + Ab組上述病理變化顯著減輕(圖1)，表明抗WISP-1治療從腎組織形態學上改善UUO小鼠腎組織纖維化。

2.2免疫組化染色顯示抗WISP-1治療減輕UUO小鼠腎組織腎纖維化的表達采用IHC來檢測各組小鼠腎臟WISP-1和纖維化標志物膠原蛋白I(Collagen I)的表達。如圖2a所示，在UUO組和UUO + IgG組的腎組織中，WISP-1主要在腎小管間質表達，少量在腎小球中表達，UUO + Ab小鼠腎組織WISP-1表達明顯降低，表明抗WISP-1抗體能有效阻斷WISP-1在腎臟表達。同時抗WISP-1治療后Collagen I的染色強度顯著降低。進一步采用半定量分析，結果顯示抗WISP-1治療能有效降低WISP-1和腎組織纖維化，各組之間差異有統計學意義(圖2b)。

圖1 各組腎組織常規病理染色(×400)

圖2 各組腎組織免疫組織化學WISP-1和Collagen I染色 a：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標Collagen I的免疫組織化學染色(×400)；b：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標Collagen I的免疫組織化學染色半定量結果比較。與Normal組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與UUO組比較，#P < 0.05

2.3WB顯示抗WISP-1治療降低UUO小鼠腎組織腎纖維化的蛋白表達本研究同時提取了各組小鼠腎組織蛋白質來檢測WISP-1和腎臟纖維化指標Collagen I的表達水平。如圖3 a所示，抗WISP-1抗體處理組后WISP-1 蛋白水平降低，表明抗WISP-抗體成功抑制UUO小鼠梗阻側腎臟中的WISP-1表達。而纖維化標志物Collagen I的蛋白表達在WISP-1抗體干預處理后也顯著降低。相反，UUO+IgG組的纖維化標志物和WISP-1表達相比UUO組無明顯改變。半定量分析各組差異有統計學意義(圖3b)。

圖3 各組腎組織蛋白質免疫印跡分析 a：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標Collagen I的蛋白質免疫印跡；b：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標Collagen I的蛋白質免疫印跡半定量結果比較。與Normal組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與UUO組比較，##P < 0.01

3 討論

無論CKD最初病因是什么，纖維化都被認為是各種CKD進展至ESRD的共同通路。腎臟纖維化的發生發展極其復雜，是多種細胞和細胞因子的相互作用導致細胞外基質在損傷的腎臟組織中累積并形成永久性瘢痕組織，最終導致腎功能喪失[7]。

研究表明Wnt/β-catenin信號通路在纖維化中起著重要作用[8]。WISP-1是Wnt/β-catenin信號通路的下游分子，，在心臟、腎臟、肺臟、胎盤、卵巢、小腸、脾和腦等多種組織中表達[9]。研究報道，在冠狀動脈左前降支永久性閉塞小鼠模型中，WISP-1在邊界區和非缺血性遙遠區上調，并刺激心臟成纖維細胞增殖[4，10]。通過激活αvβ5整合素，PI3K，Akt和NF-κB通路，WISP-1促進了滑膜纖維化[11]。研究表明，WISP-1增強了肝星狀細胞的增殖，阻斷WISP-1后，肝臟中膠原的形成和α-SMA的表達明顯減少[5，12]。此外，在肺纖維化小鼠模型和特發性肺纖維化患者中，肺泡上皮II型細胞中WISP-1的表達增加，并且特異于WISP-1的中和單克隆抗體減少了纖維化特征性基因的表達[3]。我們的前期研究首次發現[13]，WISP-1的表達不僅在TGF-β1誘導的大鼠腎小管上皮細胞纖維化和UUO小鼠模型中升高，而且在CKD患者包括局灶增生性IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)，局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)和糖尿病性腎病(diabetic kidney disease，DKD)的腎臟組織和血清中明顯升高。然而，WISP-1在腎臟纖維化中的功能尚未有研究報道。因此，本研究采用市售抗WISP-1抗體干預WISP-1在UUO模型小鼠體內表達，探索抗WISP-1治療是否影響UUO小鼠腎臟纖維化。

UUO模型是目前研究腎小管間質纖維化最常用的動物模型，以進行性小管間質纖維化為特征，梗阻時間越長，腎間質纖維化的程度越嚴重[14]。本研究發現，與正常小鼠比較，無論是在組織學上還是在蛋白的表達上，UUO小鼠在術后第7天均出現顯著的纖維化表現，表明UUO模型小鼠造模成功。

本研究采用市售抗WISP-1抗體通過腹腔注射方法干預WISP-1在UUO模型小鼠體內表達。利用WB、IHC證實UUO組及UUO+IgG組小鼠腎臟中的WISP-1表達增加，使用抗WISP-1抗體處理后，UUO+Ab組WISP-1的表達明顯降低，證實抗WISP-1治療可以成功抑制UUO小鼠腎臟WISP-1表達；更重要的是，抗WISP-1抗體組UUO小鼠的腎臟病理、纖維化程度及重要纖維化指標Collagen I均比UUO組和UUO + IgG組明顯減輕。這些重要的研究結果表明，通過WISP-1中和抗體的干預可以減輕UUO小鼠中的腎纖維化，提示WISP-1在腎臟纖維化中起致病作用。

本研究成功建立了UUO纖維化小鼠模型，并成功通過抗WISP-1抗體抑制WISP-1在UUO小鼠體內表達。我們研究結果表明WISP-1在腎纖維化中扮演了促進作用，而抗WISP-1抗體治療可以通過凋亡改善腎纖維化。本研究為腎臟纖維化的治療提供了新的靶點和途徑。