TACC2/p300/HIF-1α信號通路對結直腸癌增殖影響的研究

彭 洪，林中超

(四川省南充市中心醫院中西醫結合肛腸科，四川 南充 637000)

結直腸癌在全世界范圍內是排名第三的惡性腫瘤。每年有接近130萬新診斷病例，并且每年有70萬人因為結直腸癌而死亡。雖然近年來西方國家結直腸癌的發病率和死亡率有所下降，但是在中國和其他一些發展中國家，發病率和死亡率卻有所上升。因此，闡明其具體作用機制對于結直腸癌的早期診斷和治療至關重要。TACC2(transforming acidic coiled-coil proteins 2)是TACC蛋白家族成員之一，其主要位于中心體，可調控微管蛋白的形成和調控細胞有絲分裂，因此對于染色體的穩定具有重要作用[1]。如果TACC2蛋白表達出現變化，可能導致基因穩定性降低甚至形成腫瘤[2]。也有研究發現TACC2可與核組蛋白甲基轉移酶共同作用參與基因轉錄調控[3]。有研究報道TACC2基因的高表達與乳腺癌和前列腺癌的發病密切相關[4，5]。然而TACC2基因在結直腸癌中的表達及與結直腸癌發生發展的關系及作用機制尚未見報道。小干擾RNA(siRNA)可通過沉默目標基因來發揮作用，因此本研究采用RNA干擾技術抑制結直腸癌中TACC2基因的表達，探討TACC2在結直腸癌增殖中的作用和其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料人結直腸癌細胞系LoVo、HCT116及SW480細胞，均購自重慶醫科大學基礎研究所。2016年2月至2017年10月，收集在南充市中心醫院行根治性手術的20例結直腸癌患者的癌組織標本及匹配的癌旁正常組織，所有組織標本均經病理切片證實為原發性結直腸癌。所有結直腸癌手術患者術前未接受其他抗腫瘤治療。

1.2方法

1.2.1TACC2在結直腸癌和癌旁組織中的表達 將收集的腫瘤組織和癌旁組織標本粉粹后放于EP管中，加入細胞裂解液，混勻并冰置15 min，然后離心20 min(4 ℃，10000 g)，收集的上清液為細胞總蛋白。蛋白免疫印跡法(Western Blot)用于檢測TACC2蛋白的表達，其具體操作方法參照前期文獻。Quantity One 軟件用于分析TACC2蛋白表達水平。

1.2.2高表達TACC2蛋白的結直腸癌細胞系的篩選 蛋白免疫印跡法用于檢測人結直腸癌細胞系LoVo、HCT116及SW480細胞中TACC2蛋白的表達。

1.2.3TACC2 siRNA的設計和轉染 根據TACC2基因序列和小干擾RNA設計原則，設計TACC2 siRNA序列如下：sense 5’-GCU AAA GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’，antisense 5’-UAU CAA AGG UGU AAG UAC CUU UAG C-3’。同時設計合成與TACC2基因無同源性的陰性對照組siRNA-NC： sense 5’-CAA UAC GUA CUA UCG CGC GGA UTT-3’，antisense 5’-AUC AAA CGC GCG ATA GUA CGU ATT-3’，并設置空白對照組Blank，委托廣州萊博生物科技有限公司合成。利用腺病毒將TACC2 siRNA，siRNA-NC轉染入LoVo細胞。

1.2.4熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測TACC2基因的表達 用PCR法檢測TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank組細胞中TACC2基因的表達，具體操作步驟參考前期文獻。TACC2的上游引物：5’-AGC CAG CGA CCT GAA CCT-3’，下游引物： 5’-GAG GTC AGC ACA CAG CCA C-3’。GAPDH的上游引物：5’-CAT GCA GGC TAC CAT CCA TGT-3’，下游引物： 5’-GTT AGC AGT GAT GCC TAC CAA-3’。結果提示TACC2 siRNA沉默基因的效果最強。采用相對定量比較CT值法分析數據。

1.2.5MTT檢測細胞增殖能力 將轉染TACC2 siRNA，siRNA-NC和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞系以每孔2×104個接種于96孔板，每組4個復孔，培養24小時及48小時后每孔加MTT 20ul，4 h后棄上清液。然后每孔加二甲基亞砜(DMSO)150ul，震蕩10分鐘后于490 nm處測定吸光度(A)值。實驗重復進行3次。

1.2.6TACC2下游基因的篩選 為進一步研究TACC2基因調控細胞增殖的具體作用機制，我們從Pubmed Gene上搜索可與TACC2相互作用的下游基因，發現p300可與TACC2相互作用。

1.2.7TACC2對p300基因表達的影響 將轉染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，進行免疫印跡分析。p300蛋白的表達用Quantity One圖像分析軟件進行吸光度分析。

1.2.8TACC2對結直腸癌 LoVo細胞p300組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)活性的影響 將轉染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，應用活性光度法檢測p300-HAT活性，觀察TACC2對結直腸癌 LoVo細胞p300-HAT活性的影響。

1.2.9TACC2對缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達的影響 將轉染TACC2 siRNA和Blank組的結直腸癌 LoVo細胞以每孔2×105個接種于6孔板過夜。48小時后收集各組細胞，進行免疫印跡分析。HIF-1α蛋白的表達用Quantity One圖像分析軟件進行吸光度分析。

1.3統計學方法所有數據使用SPSS 17.0軟件進行分析。定性變量用計數(%)表示，定量變量用均數±標準差表示。計量資料符合正態分布的采用t檢驗，不符合正態分布的采用Mann-Whitney秩和檢驗。三組以上的數據采用單向方差分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TACC2蛋白在不同組織中表達水平比較TACC2蛋白在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t=53.67，P< 0.05)。見圖1。

圖1 TACC2蛋白表達 a：癌旁正常組織；b：結直腸癌組織

2.2TACC2蛋白在不同結直腸癌細胞系中的表達

TACC2蛋白在LoVo細胞中的表達水平高于HCT116及SW480，差異有統計學意義(F=1022，P< 0.05)。見圖2。因此我們選擇LoVo細胞系用于后續研究。

圖2 TACC2蛋白在不同細胞系中表達 A.LoVo細胞；B.HCT116細胞；C.SW480細胞

2.3PCR檢測靶向抑制TACC2基因后的沉默效果TACC2 siRNA，siRNA-NC和blank轉染到入LoVo細胞后TACC2基因△CT值分別為(4.09±0.02)、(2.39±0.03)、(2.41±0.03)，差異有統計學意義(F=11701，P< 0.05)。見圖3。

圖3 TACC2基因沉默效果 a. siRNA-NC；b. Blank；c. siRNA

2.4沉默TACC2基因對細胞增殖的影響將TACC2 siRNA、siRNA-NC和blank轉染入LoVo細胞后，在24小時和48小時檢測細胞增殖能力。見表1。

表1 LoVo細胞增殖能力

2.5沉默TACC2基因對p300蛋白表達的影響siRNA組與blank組對p300蛋白表達的影響差異無統計學意義(t=0.342，P> 0.05)。見圖4。

圖4 p300蛋白的表達 a. siRNA；b. blank

2.6沉默TACC2基因對p300-HAT活性的影響siRNA組p300-HAT活性為(0.00071±0.00004)，明顯低于blank組(0.00167±0.00005)，差異有統計學意義(t=49.19，P< 0.05)。

2.7沉默TACC2基因對HIF-1α表達的影響與blank組相比，siRNA組HIF-1α蛋白表達量明顯下降，差異有統計學意義(t=62.57，P< 0.05)。見圖5。

圖5 HIF-1α的表達 a： siRNA；b：blank

3 討論

RNA干擾一般是通過siRNA來實現的，其可特異性的降解同源mRNA，并可抑制目的基因的表達[6]。本實驗結果顯示基于TACC2基因的siRNA能夠有效抑制結直腸癌LoVo細胞中TACC2基因的表達，為下一步實驗的開展奠定了基礎。

TACC蛋白家族成員包括TACC1，TACC2和TACC3，這3個TACC蛋白基因組區域在某些腫瘤中存在重排，因此在不同的腫瘤組織中它們的表達水平可能不同[7～10]。如TACC3在肺癌細胞株中高表達，但是其在卵巢癌和甲狀腺癌中的表達卻明顯降低[11，12]。在細胞有絲分裂期中TACC1在中心體上定位較弱，TACC2在中心體上定位較強，而TACC3在中心體及其附近都有較強的定位[13，14]。TACC1，TACC2和 TACC3定位的不同提示它們的功能可能存在差異。既往研究發現TACC2在乳腺癌和前列腺癌中明顯高表達，并且TACC2表達水平與臨床病理特征和患者預后密切相關。進一步研究發現外源性TACC2可明顯促進乳腺癌細胞的增生，然而用siRNA沉默TACC2基因后則可明顯抑制前列腺癌細胞增殖[4，5]。到目前為止TACC2基因與結直腸癌發生發展的關系并無相關報道。本研究結果發現TACC2基因在結直腸癌中的表達明顯高于癌旁正常組織，說明TACC2參與結直腸癌的發生發展。進一步我們發現TACC2蛋白在LoVo細胞中的表達水平高于HCT116和SW480細胞中的表達，當用RNA干擾抑制TACC2基因的表達后LoVo細胞增殖能力明顯下降，提示TACC2基因可能作為一種癌基因促進結直腸癌的發生。

為進一步研究TACC2基因調控結直腸癌細胞增殖的具體作用機制，我們從Pubmed Gene上搜索可與TACC2相互作用的基因，發現p300可與TACC2相互作用。人p300基因又稱為p300蛋白，是一個重要的轉錄輔助活化因子，可為轉錄活化各組分如蛋白質之間或蛋白質和DNA之間的相互作用提供支架，并且p300可通過其具有的乙酰轉移酶(HAT)活性調節核小體組蛋白，使染色質結構變得疏松從而促進轉錄，同時p300也可以直接乙酰化一些轉錄因子調控其活性，參與DNA修復、細胞增殖、分化及細胞凋亡等生物學過程[15，16]。p300作為p53、FOXO3 a和BRCA1的轉錄輔助活化因子，可發揮抑癌作用。然而在特定條件下p300作為c-Myc和AR的轉錄輔助活化因子也可促進腫瘤的發生，如p300可通過激活AR依賴性轉錄促進前列腺癌生長，當使用siRNA下調p300表達也可以抑制其增殖[17]。并且p300在腫瘤的化療敏感性方面也有重要作用，其可介導阿霉素在膀胱癌中的化療耐藥[18]。本研究分析了TACC2和p300之間的相互作用，結果發現沉默TACC2后p300蛋白的表達并無明顯變化，但是p300-HAT活性則明顯降低，說明TACC2可能通過調控p300-HAT活性來發揮作用。

HIF-1α屬于bHLH-PAS蛋白家族，是缺氧反應的關鍵轉錄因子，其主要功能是調節機體適應缺氧環境。缺氧是惡性腫瘤包括結直腸癌的重要微環境特點，既往研究發現HIF-1α在結直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[19]，并且作為轉錄因子HIF-1α可激活下游多種靶基因促進腫瘤血管的生成，腫瘤細胞的增殖及轉移[20]。現有研究證實HIF-1α的C端反式激活域(C-terminal tmansactivation domain，CATD)可以與p300的CH1結構域結合，而CH1作為CATD結構域折疊的支架，可通過疏水極性相互作用使p300/HIF-1α復合物保持穩定[21]。p300/HIF-1α復合物可作為蛋白支架把不同轉錄因子連接到轉錄元件，同時p300具有的乙酰轉移酶可通過調節組蛋白而改變染色質活性及結構，從而影響下游靶基因如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達來調控腫瘤細胞的增殖，因此以p300/HIF-1α復合物作為靶點的轉錄調節劑在抗腫瘤方面有很好的應用前景[22]。我們的研究發現沉默TACC2基因后HIF-1α的表達明顯降低，目前尚無TACC2和HIF-1α直接作用的相關報道，我們分析其作用機制可能是因為沉默TACC2后p300-HAT活性降低，導致具有轉錄調控活性的p300/HIF-1α復合物表達下降，并進一步引起下游靶基因的表達抑制從而調控腫瘤細胞的增殖。

本實驗通過RNA干擾抑制TACC2基因的表達后研究其對LoVo細胞增殖的影響極其作用機制，發現TACC2基因沉默后可抑制結直腸癌LoVo細胞增殖，其作用機制可能與下調TACC2/p300/HIF-1α信號通路有關。本實驗證實了靶向TACC2/p300/HIF-1α信號通路的表達可為結直腸癌提供新的治療策略，當然關于TACC2基因與p300的作用靶點，與下游基因的具體調控關系，及在動物實驗中的效果還需要更加深入的研究。