透骨草總生物堿對乳腺癌骨轉移的抑制作用及其機制

杜 娟，胡向陽，劉 丹，胡 衛，陳 濤，*

（1. 三 峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002；2. 恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北恩施 445000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，中國乳腺癌發病率增速居全球首位[1-2]。骨是乳腺癌轉移最常見的部位，70%的晚期乳腺癌發生骨轉移[3-5]，對于大多數乳腺癌患者來說，骨轉移主要是溶骨性的，可導致嚴重疼痛和骨折[6]。此類患者常常選擇化療，但此方法毒副作用較大，預后較差，因此亟需一種能減輕患者痛苦、提高生活質量的治療藥物。

近年來，中醫藥治療乳腺癌取得了顯著成效，在改善患者的生存質量、延長生存期、控制病情發展等方面發揮了重要作用[7]。補腎壯骨方劑三骨湯由補骨脂、骨碎補、透骨草按一定比例組成，已有研究證明其能控制惡性腫瘤骨轉移的發生[8]，其中透骨草所含生物堿成分在抗炎鎮痛、抗癌等方面證實有一定的功效[9]。但其對乳腺癌骨轉移的作用機制尚未見報道，本研究旨在探討透骨草總生物堿(the total alkaloids of tougucao，TTAT)對人乳腺癌細胞所致溶骨性病變的影響，并對其相關機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 TTAT的提取與鑒定

透骨草，購于湖北天濟中藥飲片公司，國藥準字H45871202，批號20175687-541，每袋10 g。取透骨草500 g，粉碎得全草粉末后用80%乙醇回流提取3次，蒸發濃縮成浸膏，用1%鹽酸水溶液調節pH為2~3，抽濾，用氨水調節濾液pH至11~12，抽濾。得到的濾液用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯液，濃縮，得到透骨草總生物堿提取物。將提取物與配好的顯色劑(碘化鉍鉀試劑或改良碘化鉍鉀與碘化汞鉀試劑)反應，觀察顏色結果[10-11]。

1.2 動物及裸鼠乳腺癌脛骨骨轉移模型的建立

成年健康BALB/c-nu雌性裸鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用經營許可證號為SCXK(京)2012-0001。造模前1周復蘇凍存在液氮中的乳腺癌MDA-MB-231細胞(來源于武漢大學中國典型培養物保藏中心)，并進行培養和傳代。用0.4%臺盼藍染色后，在顯微鏡下觀察細胞活性，計數活細胞率>95%時收集細胞，用無菌PBS將細胞密度調整至1×107/mL，用10 μL微量進樣器從裸鼠右后肢脛骨平臺刺入，向脛骨腔內注射細胞懸液10 μL，用手輕捏進針口2 min至針口閉合。

1.3 分組給藥及取材

鹽酸多柔比星粉劑(doxorubicin，DOX)，海正輝瑞制藥有限公司(中國)，國藥準字H33021980，批號2017 482-4，每瓶10 mg；DOX是一種抗腫瘤抗生素，在臨床上常用于乳腺癌的化療，主要用來觀察透骨草總生物堿的抗腫瘤能力是否與常規化療藥效果一致[12]。唑來膦酸注射液(zoledronic acid，ZOL)，正大天晴藥業集團股份有限公司(中國)，國藥準字H20041346，批號845125-9875，每支5 mL，含4 mg；ZOL是一種作用于骨的特異性二磷酸化合物，它能抑制因破骨細胞活性增加而導致的骨吸收，主要用來觀察透骨草總生物堿抗乳腺癌骨質破壞的能力[13]。

將42只裸鼠分為正常組(不予任何處理)、模型組(僅造模，不予其他處理)、TTAT低濃度組(100 mg/kg TTAT腹腔注射)、TTAT高濃度組(500 mg/kg TTAT腹腔注射)、DOX組(5 mg/kg DOX腹腔注射)、ZOL組(0.4 mg/kg ZOL頸后皮下注射)，每組7只。除正常組和模型組外，其余組造模1周成瘤后開始給藥，隔日1次。給藥期間，每周定期(1~2 d)觀察裸鼠生存狀態，并稱體質量，計算腫瘤體積，用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，算出每組平均值。處死裸鼠后，剝離腫瘤組織，經電子天平稱量瘤質量，計算各組平均瘤質量和平均腫瘤體積，最后計算抑瘤率。連續給藥6周。采用頸椎脫臼法處死各組裸鼠，以右側髖關節為界切除右后肢，取右后肢腫瘤組織放入-80 ℃冰箱保存待檢。

1.4 影像學技術及評分標準

以右側髖關節為界切除右后患肢，運用TUC-4653P醫用X光診斷系統進行X線攝片并評分，分析標準[14]如下：0分，正常骨性結構，即無任何骨質破壞征象；1分，脛骨注射部位附近見小的骨質缺損灶(≤3個)；2分，髓質骨缺損，病灶增多(>3個)；3分，髓質骨缺失，同時皮質骨受侵；4分，單面骨皮質完全缺損；5分，雙面骨皮質缺失，移位性骨折。由2位研究者分別計分，并計算平均值。

1.5 HE染色

脛骨標本固定后轉入不同濃度的酒精進行組織脫水，再將組織塊置于二甲苯中透明，常規石蠟包埋切片，切片包括骨組織及骨旁腫瘤組織。HE染色后在光鏡下觀察，每張切片隨機選取5個視野拍照。

1.6 破骨細胞計數(TRAP染色)

脛骨標本固定約24 h后轉入脫鈣液(10%甲醛+EDTA過飽和溶液)脫鈣8周，石蠟包埋切片，切片包括骨組織及骨旁腫瘤組織。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acid phosphatase staining，TRAP)染色后在光鏡下觀察，每張切片隨機選取5個視野拍照，計數，取平均值表示其破骨細胞數。

1.7 Western blot檢測裸鼠腫瘤組織中RANKL、OPG、p-ERK、ERK、p-JNK以及JNK的表達

取裸鼠骨轉移部位腫瘤組織，加裂解液提取組織蛋白質，超聲裂解得蛋白上清液并記錄體積，BCA蛋白定量試劑盒進行組織蛋白定量。取30 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉至硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane，NC)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗：鼠抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)稀釋比例為1∶500；兔多抗骨保護素(osteoprotegerin， OPG)和 兔 多 抗 核 因 子 -κB配 體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)(上海艾博抗貿易有限公司)，稀釋比例均為1∶200；兔單抗細胞外信號調節激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK(美國CST公司)，稀釋比例均為1∶400，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。加入相應HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，稀釋比例為1∶500)，室溫作用2 h，TBST洗膜3次。用ECL Western blot化學發光試劑盒顯色檢測，以β-actin為內參。

1.8 統計學方法

統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用x±s表示，組間比較采用LSD法分析，應用方差分析和t檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 TTAT的提取和測定結果

提取得到透骨草總生物堿3.28 g，加入碘化鉍鉀試劑或改良碘化鉍鉀均產生橘紅色沉淀，加入碘化汞鉀試劑產生類白色沉淀，證明提取物中含有生物堿。

2.2 TTAT對裸鼠腫瘤生物學行為的影響

2.2.1 各組裸鼠腫瘤質量及體積變化情況和抑瘤率與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT處理組均可顯著抑制腫瘤生長(P<0.05)；與DOX 組比較，100 mg/kg TTAT劑量組腫瘤體積和瘤質量增加即腫瘤抑瘤率降低(P<0.05)；500 mg/kg TTAT組上述指標間的差異均無統計學意義(P>0.05)；與ZOL組比較，上述2個TTAT劑量組的腫瘤體積和瘤質量均下降即腫瘤抑瘤率明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤質量及體積變化情況和抑瘤率對比(-x±s，n=7)

2.2.2 TTAT對乳腺癌骨轉移裸鼠骨質破壞的影像學檢測 影像學評分顯示，與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT均能夠明顯降低乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢骨質破壞情況和影像學評分(P<0.05)。與DOX組比較，TTAT 500 mg/kg組能夠明顯降低乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢骨質破壞況和影像學評分(P<0.05)。但100和500 mg/kg TTAT組對骨質破壞及影像學評分的影響較ZOL組弱(P<0.05)，見圖1和表2。

表2 各 組裸鼠影像學評分 (-x±s，n=7)

圖1 TTAT對乳腺癌骨轉移裸鼠骨質破壞的影像學檢測

2.2.3 各組乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢HE染色 HE染色結果顯示，模型組中腫瘤細胞密度高，核大深染，見病理核分裂像，異型性明顯，骨質破壞明顯，呈溶骨性破壞。與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組中腫瘤細胞彌漫分布，排列較緊密，間質增多，部分腫瘤細胞形態不規則。與DOX組比較，500 mg/kg TTAT組中腫瘤細胞與之呈相同形態，異型性減輕，體積縮小，排列較松散，間質增多，出現較多變性和壞死，但骨質破壞比DOX組明顯減輕。與ZOL組比較，500 mg/kg TTAT組腫瘤細胞異型性明顯降低，彌漫分布，排列較緊密，間質增多，部分腫瘤細胞形態不規則，而骨質破壞情況與之相當，均較模型組明顯減輕。見圖2。

圖2 各組乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢HE染色

2.2.4 各組乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢TRAP染色及破骨細胞計數 TRAP染色結果顯示，骨組織及骨小梁呈淡黃色，細胞核呈藍色，破骨細胞呈酒紅色，模型組可見明顯的骨破壞，且破骨細胞數量明顯多于其他各組(P<0.05)。與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均能夠降低破骨細胞的數量(P<0.05)。與DOX組比較，500 mg/kg TTAT組能明顯降低破骨細胞的數量(P<0.05)。500 mg/kg TTAT組降低破骨細胞數量的能力與與ZOL組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。如圖3所示。

2.3 TTAT對OPG/RANKL/RANK信號通路的影響

圖3 各組乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢TRAP染色及破骨細胞計數

與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均上調了OPG的表達，OPG/RANKL的比值升高(P<0.01)。與DOX比較，500 mg/kg TTAT組降低了RANKL的表達，OPG/RANKL的比值亦升高(P<0.05)。與ZOL比較，100和500 mg/kg組上調了RANKL的表達，OPG/RANKL的比值降低(P<0.05)，如圖4所示。

與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均能降低ERK、JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。與DOX組比較，上述2個TTAT劑量組中p-ERK表達量的差異無統計學意義(P>0.05)，500 m g/kg T TAT組中p-JNK的表達量明顯降低(P<0.05)。與ZOL組比較，500 m g/kg T TAT組中p-ERK、p-JNK的表達量顯著降低(P<0.05)，如圖5所示。

3 討 論

正常的骨代謝依靠破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成之間的動態平衡來維持。乳腺癌轉移至骨組織，可激活破骨細胞的活性，導致骨代謝失衡，骨組織被分解，致使骨質吸收。有研究發現OPG、RANKL和RANK是調節破骨細胞和骨吸收的重要因子[15-16]。

圖4 TTAT對乳腺癌骨轉移裸鼠OPG/RANKL比值的影響

圖5 TTAT對乳腺癌骨轉移裸鼠腫瘤轉移ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白表達的影響

RANKL能直接啟動破骨細胞前體細胞或破骨細胞內信號傳導過程，維持破骨細胞活性[17]。破骨細胞表面的RANK是RANKL刺激破骨細胞分化、成熟的唯一靶受體[18-19]。巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor，M-CSF)能夠促使破骨細胞與骨髓基質細胞接觸，使 RANK/RANKL經細胞內信號傳導途徑刺激破骨細胞活化[20]。OPG是一種分泌性可溶性蛋白[21]， 是RANKL誘騙受體[22]，可與RANKL競爭性結合，阻斷RANKL/RANK間的相互作用，使RANKL失去功能，從而抑制體內及體外破骨細胞的分化，抑制成熟破骨細胞的活性，并誘導成熟破骨細胞的凋亡，從而起到減少骨吸收的作用[23-25]。因此，在破骨細胞分化成熟過程中OPG/RANKL比值起主要的調節作用[26-27]，也就是說OPG/RANKL系統在乳腺癌骨轉移骨吸收和重建中起關鍵作用[28]。

RANKL主要由骨髓間質細胞和成骨細胞分泌，破骨細胞不分泌RANKL[29]。有研究發現RANK能夠誘導RANK陽性的前列腺癌細胞發生轉移，證明RANKL具有趨化因子活性[30-32]。RANKL誘導的轉移與特殊的信號有關，特別是MAPKs通路(JNK和ERK)的激活，ERK和JNK是MAPK信號傳導通路中經典的信號蛋白分子，MAPK是一類由脯氨酸介導的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過Ⅷ區域蘇氨酸、酪氨酸雙位點磷酸化活化，激活的MAPK通過磷酸化多種轉錄因子、細胞骨架蛋白、其他酶類等不同底物來調節多種細胞生理過程，其中ERK主要通過Ras→Raf→MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase，MEK) 被激活，可能與生理性信號傳導有關，促進細胞的增殖，有利于損傷的修復和細胞的再生，對破骨細胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收有重要作用[33]。

本實驗結果顯示TTAT能顯著抑制裸鼠骨腫瘤的生長，抑制破骨細胞的分化，顯著抑制RANKL誘導的胞質ERK和JNK的磷酸化水平，在TTAT高濃度組這種抑制作用更加明顯。結果表明OPG/RANKL/RANK信號通路在乳腺癌骨轉移中起著重要作用，TTAT能夠通過上調OPG/RANKL的比值進而調控其下游信號轉導通路來抑制腫瘤細胞的轉移和骨質的破壞，由此可見抑制OPG/RANKL/RANK信號通路的表達可能成為減少腫瘤骨轉移的潛在方法之一，TTAT有望開發成為抗腫瘤轉移的有效藥物。