UPLC/Q-TOF MS/MS技術評價防腐劑硼酸和疊氮化鈉對尿液代謝物的影響

肖 瑤，王美杰，侯紹英*

（哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

代謝組學是研究代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的一門學科，自Nicholson等[1]于1999年提出“代謝組”一詞后，代謝組學在篩選疾病的生物標志物[2-3]以 及療效評價[4]等多個方面展現(xiàn)出良好應用前景。代謝組學分析流程包括樣品采集、樣品前處理、儀器檢測、數(shù)據(jù)分析等幾個環(huán)節(jié)，為了得到真實可靠的實驗結(jié)果，各環(huán)節(jié)都需嚴格設計、精確執(zhí)行。其中，對樣品進行適宜的前處理至關重要[5]。

尿液是代謝組學研究常用的生物樣本，它具有很多優(yōu)點。首先，尿液中含有豐富的代謝產(chǎn)物，并且大多數(shù)代謝產(chǎn)物能反映機體的代謝變化信息[6-7]；其次，尿液是機體的排泄廢物，采集方便、快捷，對生命體本身無侵襲性，并且收集的體積幾乎不受限制。但尿液樣本在收集過程中，常常會受細菌微生物等因素的影響，從而使其中的代謝物發(fā)生變化[8]，可能導致錯誤的分析結(jié)果。為解決這一問題，很多學者在尿液樣品中添加防腐劑，以抑制細菌生長繁殖[9]，但其前提是這些防腐劑不影響尿液中的代謝物。此前曾有學者采用光學技術以及基于核磁共振波譜技術(nuclear magnetic resonance，NMR)的代謝組學技術探討了常用防腐劑作用效果以及對代謝物的影響。但由于NMR技術的靈敏度低于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC/QTOF MS/MS)，而后者在代謝組學研究中應用越來越廣泛，所以基于該技術平臺闡明防腐劑對尿液代謝物的影響就顯得很重要。因此，我們在尿液中添加兩種常用防腐劑硼酸和疊氮化鈉，在基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術的代謝組學研究中觀察其對尿液代謝物的影響，篩選適宜的防腐劑及其適宜的濃度范圍，以便為后續(xù)研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

采用Waters超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進行樣品檢測。HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1×100 mm)購于Waters公司，色譜級乙腈和甲醇購于Dikma公司，色譜級甲酸購于Fisher公司，亮氨酸腦啡肽購于Sigma公司。采用Millipore公司的Milli-Q超純水系統(tǒng)制備超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與尿液處理 采用進口離心管收集哈爾濱醫(yī)科大學6名健康志愿者的晨尿(男女各3名)，各取40 mL等量混勻并分裝。按處理方式不同分為3個組，即對照組、疊氮化鈉組(NaN3)和硼酸組(boric acid)，其中對照組不添加任何防腐劑，疊氮化鈉組中分別添加終濃度為0.1、1和10 mmol/L的疊氮化鈉；硼酸組則在尿液中分別添加終濃度為2、20和200 mmol/L的硼酸。

每個處理均設置4個平行樣。尿樣在4 ℃下以3 000 g離心5 min，吸取上清100 μL，加入1 100 μL超純水，渦旋混勻后，再次于4 ℃以12 000 g離心10 min。輕吸上清液1 000 μL置于進樣瓶中。檢測時為避免誤差，將各組樣品隨機進樣。

等量吸取所有樣品并混勻，制成質(zhì)控樣品(quality control，QC)。每隔15個樣品各采集一次QC和純乙腈(空白樣品)，以便進行質(zhì)量控制。

1.2.2 UPLC/Q-TOF MS/MS條件 采用Waters UPLC HSS T3色譜柱進行樣品的分離。柱溫設置為35 ℃，自動進樣室溫度設置為4 ℃。流動相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為100%乙腈。流速為0.45 mL/min，進樣量為2 μL。洗脫方法如表1所示。

表1 UPLC梯度洗脫程序

質(zhì)譜分析器由四級桿質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜儀串聯(lián)而成，采用電噴霧離子源(electrospray ion source，ESI)分別采集正、負兩個離子模式下質(zhì)荷比50~1 200范圍的離子。質(zhì)譜掃描采用MSE連續(xù)模式，采集時間為0~16 min。質(zhì)譜分析參數(shù)如下：毛細管電壓為0.5 kV，錐孔電壓為60 V，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃，錐孔氣流為50 L/h，脫溶劑氣流為900 L/h。在整個檢測過程中，使用200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽作為質(zhì)譜校正離子([M+H]+=556.277 1，[M+H]-=554.261 5)進行儀器的實時校正，掃描時間為0.2 s，間隔時間為15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將檢測得到的數(shù)據(jù)導入Progenesis QI軟件(Waters)進行峰識別、峰提取和歸一化后，將數(shù)據(jù)導入SIMCAP 13.0軟件(Umetrics)，采用主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal projection to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析方法進行分析。根據(jù)變量權重的重要性排序值(variable importance in projection，VIP)進一步篩選具有差異的變量，選擇其中差異倍數(shù)大于2且P<0.05者為差異代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的可靠性

分別采用空白樣品和QC樣品，對實驗過程進行質(zhì)量控制。對4個空白樣品的色譜圖重疊處理后(圖1A)發(fā)現(xiàn)它們的色譜圖重疊在一起，沒有額外的色譜峰出現(xiàn)，說明整個分析過程中色譜柱中沒有物質(zhì)殘留，不存在交叉污染問題。

對各處理組樣品和QC進行PCA分析，發(fā)現(xiàn)在PCA得分圖中(圖1B)，QC樣品聚集并位于所有樣品的中間，說明了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2 防腐劑種類和濃度對尿液代謝物的影響

我們分別在正負兩個離子模式下進行了數(shù)據(jù)采集。正離子模式下，對所有防腐劑組和對照組進行分析，觀察各組數(shù)據(jù)的聚類情況，結(jié)果如PCA得分圖(圖2A，R2X=0.913，Q2=0.882)，說明模型的擬合度和預測性良好。在PLS-DA得分圖(圖2B，R2Y=0.243，Q2=0.050)中可以看出，終濃度為2、20 mmol/L的硼酸處理組，以及0.1、1和10 mmol/L NaN3處理組，均與對照組樣品聚集在一起，沒有明顯的分離趨勢；而終濃度為200 mmol/L硼酸處理組與對照及其他樣品組顯著分離，提示加入硼酸的終濃度達到200 mmol/L時對尿液的代謝物有影響。

圖1 儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)可靠性評估圖

為了更好觀察對照組與2、20 mmol/L硼酸處理組以及NaN3處理組之間的差異，我們暫時將200 m mol/L硼酸組移除，再次進行PLS-DA分析(圖2C，R2Y= 0.140，Q2=0.035)，發(fā)現(xiàn)對照組樣品與這些處理組的尿樣之間沒有分離趨勢，說明加入終濃度為2~20 mmol/L 硼酸和0.1~10 mmol/L NaN3不會對尿液代謝產(chǎn)物產(chǎn)影響。

圖2 不同防腐劑處理組與對照組比較的分析圖

對負離子模式下的數(shù)據(jù)進行處理后，我們發(fā)現(xiàn)終濃度為20和200 mmol/L硼酸處理組樣品與對照及其他組樣品有明顯的分離趨勢。

2.3 200 mmol/L硼酸處理對尿液代謝物的影響

對200 mmol/L硼酸組和對照組作PCA和PLS-DA分析(圖3A，R2X=0.963，Q2=0.921；圖3B，R2Y=0.976，Q2=0.949)，發(fā)現(xiàn)兩組樣品得到很好的區(qū)分，說明模型穩(wěn)定且有較高的預測性。為了防止過度擬合，進一步對該PLS-DA模型做了置換檢驗(圖3C)，圖中左側(cè)隨機實驗數(shù)值均低于右側(cè)原始值，說明模型的有效性。

進一步進行OPLS-DA分析(圖3D)，可看到200 mmol/L硼酸組和對照組顯著分離，該模型的R2=0.976，Q2=0.955。為了觀察在兩組有顯著差異的代謝物，我們篩選VIP>1、差異倍數(shù)大于2倍，且P<0.05的代謝物，最終得到235個差異代謝物，與對照組相比其中有147個的濃度升高，88個濃度降低。在負離子模式下，我們得到更多的差異代謝物，其中VIP>2的差異代謝物有92個。以上結(jié)果說明經(jīng)200 mmol/L硼酸處理后，尿液代謝物有明顯改變，所以不宜應用于基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術的尿液代謝組學研究。

圖3 濃度為200 mmol/L的硼酸處理對尿液代謝物影響分析圖

3 討 論

在代謝組學研究中，采用適宜的樣品前處理方法以保證樣品真實反映機體生理病理狀態(tài)，這一點至關重要[5，10]。尿液是代謝組學研究中常用的樣品，在收集過程易受到微生物的污染。在室溫下，尿液中細菌菌落數(shù)變化顯著，可能導致錯誤的臨床診斷[9]。而細菌繁殖可消耗葡萄糖、還原硝酸鹽或者分解尿素使pH升高，使尿液成分發(fā)生改變，最終結(jié)果可能無法真實反映機體的病理生理狀態(tài)。Rotter等[8]通過流動注射電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜靶標分析發(fā)現(xiàn)人類尿液在室溫(20℃)存放24 h后，精氨酸、色氨酸和己糖等6種代謝物明顯下降。由此可見，控制微生物污染對樣品成分的影響至關重要，NaN3和硼酸等防腐劑能有效抑制微生物繁殖，但目前的證據(jù)大多是基于NMR技術的，考慮到UPLC/Q-TOF MS/MS技術的靈敏度更高，且應用越來越廣泛，因此本文采用UPLC/Q-TOF MS/MS技術探討NaN3和硼酸這兩種防腐劑對尿液代謝物的影響，最終發(fā)現(xiàn)0.1~10 mmol/L的NaN3和2 mmol/L的硼酸適于基于UPLC/Q-TOF M S/MS技術的尿液代謝組學研究。

研究中人們常采用多種防腐劑進行樣品處理以消除微生物繁殖引起的代謝物改變，有學者研究了多種防腐劑的抑菌效果。Thongboonkerd等[11]研究了2~200 mmol/L硼酸和0.1~10 mmol/L NaN3的防腐效果。他們分別采用紫外可見分光光度法和革蘭氏染色對細菌的繁殖進行確認，發(fā)現(xiàn)以上濃度的兩種防腐劑可以有效抑制細菌生長，而且10 mmol/L NaN3和200 mmol/L硼酸組中的防腐作用能至少持續(xù)48 h，因此認為200 mmol/L硼酸和10 mmol/L NaN3的抑菌效果更好。Eisinger等[9]采用尿液防腐管(BD Vacutainer Plus Urine C&S reservative Tubes，主要成分是硼酸和甲酸鈉等)發(fā)現(xiàn)其可以有效抑制細菌生長長達48 h，但他們沒有進行其他方面的實驗室檢驗。而Eksioglu等[12]則采用另一種尿液防腐管(BD Vacutainer?Plus Urinalysis Preservative Tubes，主要成分是丙酸鈉)，在不同時間點對防腐管中尿液進行生化指標的分析，發(fā)現(xiàn)4 h后樣品中蛋白質(zhì)減少了20%；48 h后血紅蛋白減少了36%，白細胞酶減少了23%，該結(jié)果提示尿液中的代謝物發(fā)生了改變。以上研究均說明，在基于光學技術或者一般生化檢測技術的研究中，NaN3和硼酸能有效抑制尿液樣品中微生物的繁殖。但由于代謝組學中常用的液質(zhì)聯(lián)用和NMR等技術的靈敏度遠遠高于這些傳統(tǒng)的技術，所以這些防腐劑是否仍適用于代謝組學中尿液樣品的處理，仍值得進一步探討。

Smith等[13]采 用基于1H NMR技術的研究發(fā)現(xiàn)，0~30 mmol/L的硼酸鹽與甘露醇、檸檬酸等化學物之間相互作用，但與個體差異相比，該變化非常微弱，因此認為0~30 mmol/L的硼酸可應用于基于NMR技術的尿液代謝組學研究。但由于NMR相對靈敏度低、動態(tài)范圍有限[14]，而UPLC/Q-TOF MS/MS的靈敏度和分辨率顯著高于NMR[15]， 所以Smith等[13]的結(jié)果并不能直接應用于基于UPLC/Q-TOF MS/MS的代謝組學研究。Roux等[16]在尿液中添加200 mmol/L硼酸，采用液質(zhì)聯(lián)用技術檢測后發(fā)現(xiàn)，加入200 mmol/L硼酸的尿樣與未加入者有一定分離趨勢，因此認為200 mmol/L硼酸雖能抑制細菌生長，但對尿液中的代謝物有一定影響，該結(jié)果與本文一致。本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)雖然在正離子模式下20 mmol/L硼酸未對尿液代謝圖譜產(chǎn)生明顯影響，但在負離子模式下20 mmol/L硼酸處理后的尿液樣品與對照組有明顯分離趨勢，因此我們認為將硼酸作為防腐劑應用于尿液代謝組學研究時，濃度應低于20 mmol/L。

Lauridsen等[17]使用NaN3作為防腐劑處理尿液樣品，采用NMR技術對樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)0.1% NaN3(相當于15.38 mmol/L)處理的樣品與對照組沒有分離趨勢，說明0.1% NaN3適于基于NMR技術的尿液代謝組學研究。本研究發(fā)現(xiàn)10 mmol/L NaN3處理對尿液代謝圖譜無明顯影響，該濃度比Lauridsen等[17]所用的NaN3濃度要低，但考慮UPLC/Q-TOF MS/MS檢測技術的靈敏度，同樣可以認為添加NaN3對尿液代謝物影響較小。

綜上所述，在基于UPLC/Q-TOF MS/MS技術的尿液代謝組學研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.1~10 mmol/L NaN3和2 mmol/L硼酸可有效抑制微生物的繁殖，同時對尿液中的代謝物影響較小，是比較適宜的尿液樣品的處理方法。但高濃度的硼酸到底影響了哪些代謝產(chǎn)物，尚需進一步確認。