泛素結合酶E2 A 在順鉑誘導的HeLa細胞應激反應中的作用

王玉強，李紅娟，蔣天靚，曹亦菲，楊 軍，2，*

（1. 杭 州師范大學醫學院，浙江 杭州310016；2. 浙江大學附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室，浙江 杭州 310003）

順鉑(cisplatin)自研制成功以來已經成為治療多種腫瘤的一線藥物，如卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、肺癌等[1-2]。DNA是順鉑作用的重要靶點，可以誘導鏈內交聯(intrastrand crosslink)、鏈間交聯(interstrand crosslink)、DNA-蛋白質交聯(DNA-protein crosslink)等的形成，從而激活細胞應激反應(cellular stress response)，最終可導致細胞周期停滯或者細胞死亡[3-4]。但是對順鉑的耐藥是困擾其臨床應用的一個重大問題，因此，更加深入了解順鉑誘導的細胞應激反應的分子機制可以為改善順鉑的治療效果提供新的思路和靶點。

針對這一問題，我們嘗試通過對基因表達譜的分析，發現和鑒定與順鉑誘導的細胞應激反應有關的基因和信號通路。前期研究結果發現順鉑作用宮頸癌HeLa細胞后可導致許多基因表達水平的改變，包括已知的p53、p21、NDRG2、Bcl-2等基因[5-7]。同時，我們還發現了許多未被報道的參與順鉑誘導細胞應激反應的基因，如人源泛素結合酶E2 A(ubiquitinconjugating enzyme E2 A，UBE2A)基因。UBE2A基因的研究相對較少，其功能仍然不明確，但已有的研究結果提示它可能是一種與DNA損傷修復相關的基因，與腫瘤的發生、發展和轉歸有一定的關系[8]。因此，本研究針對UBE2A在順鉑誘導的細胞應激反應中的作用開展了進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細胞株為楊軍教授課題組保存；DMEM高糖培養基、胰酶-EDTA、青/鏈霉素均購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；胎牛血清購自美國Biological Industries；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均購自日本TaKaRa公司；PCR試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；瓊脂糖購自美國Hydragene公司；順鉑購自美國Sigma公司。人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer和陰性對照(RNAi negative control)由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer 包括針對轉錄本1(NM_003336.3)的UBE2A-homo-434、UBE2A-homo-461和針對UBE2A基因全部轉錄本的UBE2A-homo-257、UBE2A-homo-468。具體序列見表1。

表1 人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer序列

1.2 細胞培養

HeLa細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基(內含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下常規培養。

1.3 PCR擴增目的基因

根據GenBank報告的基因序列，利用Primer-BLAST設計1對PCR引物，由上海生工合成。引物序列：上游5"-AACCCGAGACCCCAGTGTAT-3"；下游5"-GGACTCCAACGGTTCTGAAGT-3"，預測產物長度為339 bp。

將處于對數生長期的HeLa細胞分別接種于6孔板，在貼壁細胞鋪滿底面積的70%~90%時分為對照組和實驗組。實驗組加入順鉑儲存液(1 mmol/L)至終濃度為 10 μmol/L， 對 照 組 加 入 等 體 積 PBS。 24 h后 用RNAiso Plus提取兩組細胞的總RNA，Nano Drop 2000檢測總RNA濃度及純度，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。然后PCR擴增目的基因，PCR反應體系為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后于72 ℃延伸2 min。PCR產物取10 μL，加入2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外成像分析儀照相保留結果。

1.4 細胞處理條件及RNA提取

將處于對數生長期的HeLa細胞分別接種于6孔板，在貼壁細胞鋪滿底面積的70%~90%時分為對照組和實驗組。實驗組加入順鉑儲存液(1 mmol/L)至終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μmol/L，對照組加入等體積PBS。再分別于12、24、48 h后用RNAiso Plus提取各組細胞的總RNA，Nano Drop 2000檢測總RNA濃度及純度，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。PCR擴增目的基因及瓊脂糖凝膠電泳實驗方法同1.3。

1.5 瞬時轉染

根據GenBank報告的基因序列，利用Primer-BLAST設計2對PCR引物，由上海生工合成。引物1用來檢測UBE2A轉錄本1的表達，序列為：上游5"-ACCA CCTACAGTTAGATTTGTCTCT-3"；下游5"-CCTGGCTG TTTGCTGGACTA-3"；引物2用來檢測UBE2A全部轉錄本的表達，序列為：上游5"-TAGTCCAGCAAACAGCC AGG-3"；下游5"-AAACTGTACCCGGGGTCAAC-3"。

將處于對數生長期的HeLa細胞分別接種于24孔板，在貼壁細胞鋪滿底面積的70%~90%時進行轉染。轉染按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行。先將20 pmol siRNA Oligomer(實驗樣品)或RNAi Negative Control Oligomer(陰性對照) 稀釋于50 μL的DMEM培養液中(無血清)，輕柔混勻。再將1 μL脂質體LipofectamineTM2000稀釋于50 μL的DMEM培養液中(無血清)，輕柔混勻，室溫靜置3~5 min。將上述兩液體混合，室溫靜置20 min。將混合液加入24孔板中混勻。轉染24 h后，用RNAiso Plus提取各組細胞的總RNA，Nano Drop

2000檢測總RNA濃度及純度，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。再按照實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)試劑盒說明書檢測各組不同樣本的CT值 (基本循環數) 以及各組樣本中內參GAPDH的CT值 ，按照?CT= CT，目標- CT，參照，值RQ。結束后記錄實驗組、對照組(等體積無血清培養基)及陰性對照組(RNAi negative control)的法計算實驗組、陰性對照組與對照組之間UBE2A mRNA 表達量的關系。

1.6 瞬時轉染及聯合順鉑作用

將處于對數生長期的HeLa細胞分別接種于6孔板，在貼壁細胞鋪滿底面積的70%~90%時進行轉染。轉染按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行。實驗組分別加入UBE2A-homo-434、UBE2A-homo-257 siRNA Oligomer，對照組加入等體積的培養基。轉染5 h后，消化細胞，轉接于96孔板，設置空白組(只含培養基不含細胞)、對照組(含細胞)、順鉑處理組、UBE2A-homo-434實驗組和UBE2A-homo-257實驗組，各組均設3個復孔。轉染24 h后，各組(除對照組)分別加入順鉑儲存液(1 mmol/L)至終濃度為10 μmol/L，對照組加入等體積PBS。繼續培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，選擇450 nm波長，參考波長為650 nm，測定D(450)值，計算各組細胞的存活率。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 順鉑作用后UBE2A mRNA表達水平

利用RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測順鉑作用后HeLa細胞中UBE2A mRNA表達水平，結果發現PCR產物為2個條帶，其中對應預測產物339 bp的條帶較亮，而對應于249 b p位置的條帶較弱，未見其他明顯非特異性擴增雜帶及拖尾現象(圖1)。為明確這2個條帶是否都是UBE2A轉錄產物，我們對其進行測序分析，根據探針序列及測序結果，我們發現這兩個條帶都是UBE2A轉錄產物，其中249 bp條帶與339 bp條帶相比，缺少了UBE2A基因外顯子4的部分序列。該結果提示在HeLa細胞中，正常情況下UBE2A基因表達至少兩個不同的轉錄本。為方便進一步研究，我們將339 b p條帶命名為轉錄本1(U-1)，249 bp條帶為轉錄本2(U-2)。在順鉑作用HeLa細胞后，我們發現U-1和U-2的表達水平均升高(圖1)。為了進一步驗證上述結果，我們還檢測了順鉑終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μ mol/L及作用時間分別為12、24、48 h時U-1和U-2的表達水平，證實了上一實驗結果的可靠性，并發現順鉑濃度為10μmol/L，作用時間24 h 時效果最明顯，見圖1。

圖1 10 μmol/L順鉑作用24 h后UBE2A mRNA表達水平

2.2 瞬時轉染HeLa細胞后UBE2A mRNA表達水平

為進一步研究UBE2A基因的功能，我們設計了針對U-1的siRNA(UBE2A-homo-434和UBE2A-homo-461)；針對U-2的siRNA由于序列問題無法成功設計，因此只能設計針對全部轉錄本的siRNA(UBE2A-homo-257和UBE2A-homo-468)。其中針對U-1的UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-461 siRNA轉染細胞24 h后采用qPCR檢測U-1表達水平，發現U-1表達水平均降低，U-1表達量分別為對照組的27.43%、78.31%，差異均有統計學意義(P均<0.05)，結果見圖2。因此UBE2A-homo-434 siRNA轉染后U-1表達水平更低，干擾效果更好。

圖2 瞬時轉染HeLa細胞后U-1表達水平

同樣對針對UBE2A全部轉錄本的UBE2A-homo-257 siRNA和 UBE2A-homo-468 siRNA轉染細胞24 h后采用qPCR檢測UBE2A mRNA表達水平，發現UBE2A mRNA表達水平均降低，UBE2A mRNA表達量分別為對照組的15.81%、21.20%，差異均有統計學意義(P均<0.05)，結果見圖3。因此UBE2A-homo-257 siRNA轉染后UBE2A mRNA表達水平更低，干擾效果更好。故后續實驗選擇UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA 進行研究。

圖3 瞬時轉染HeLa細胞后UBE2A mRNA表達水平

2.3 UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA轉染對HeLa細胞在順鉑作用下存活率的影響

使用UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA轉染HeLa后，CCK-8檢測順鉑作用后細胞存活情況。結果顯示，順鉑處理組、UBE2A-homo-434實驗組、UBE2A-homo-257實驗組細胞存活率分別為78.79%、64.33%、59.59%，轉染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa細胞與對照和順鉑處理組相比，差異均有統計學意義(P均<0.05)，結果見圖4。這一結果提示，抑制 UBE2A轉錄本1或全部轉錄本的表達，可增加HeLa細胞對順鉑細胞毒性的敏感性，降低其存活率。

3 討 論

順鉑作為最常用有效的化療藥物之一，廣泛用于多種實體瘤包括宮頸癌的治療[9]。但在許多患者中順鉑耐藥限制了其療效，影響了患者的預后。有研究顯示，通過下調宮頸癌HeLa細胞中STAT3、Livin、Survivin基因的表達水平，均能夠提高對順鉑細胞毒性的敏感性[10-12]。在前期基因芯片研究中我們發現，順鉑作用宮頸癌HeLa細胞后UBE2A基因表達水平發生改變，提示UBE2A可能參與了順鉑引起的HeLa細胞DNA損傷應激反應。在本研究中，我們進一步證明了UBE2A可被順鉑誘導表達。更值得注意的是在檢測過程中發現該基因具有兩個轉錄本，其中一個缺少了外顯子4的部分序列(U-2)。

圖4 抑制UBE2A表達及順鉑作用后各組細胞存活率

一個基因的不同轉錄本往往是變異剪接(alternative splicing)的產物。變異剪接是高等真核有機體在發育和應激反應中調控基因表達的一種主要機制，變異剪接能夠調控一個蛋白是否被表達，或產生編碼具有不同功能蛋白的pre-mRNAs，研究發現，接近94%的人類基因編碼可發生變異剪接[13]。我們和他人在前期研究中已發現在外源化學物誘導的細胞DNA損傷應激反應中會出現變異剪接，而這些變異剪接異構體可能通過不同的方式對原來的蛋白功能發生影響，從而調控細胞的應激反應[14-15]。因此，對于UBE2A基因的兩個不同轉錄本的功能研究就成為我們的關注重點。

RNAi作為一種干擾或封閉基因表達的工具而被廣泛應用于實驗研究中。本研究初始計劃設計兩組siRNA，分別針對人UBE2A基因的轉錄本U-1和U-2，但由于兩個轉錄本間差異較小，無法設計出針對U-2的siRNA，因此改為針對UBE2A基因全部轉錄本的siRNA。本研究采用RNAi技術成功降低了UBE2A全部轉錄本(包括U-1和U-2)在HeLa細胞中的表達，再次證實了RNAi的有效性。

本研究結果顯示，轉染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa細胞與對照組相比，在順鉑處理后其存活情況出現明顯差異，存活率較順鉑處理組分別下降了14.46%和19.20%，差異有統計學意義。此外，單純抑制U-1表達與抑制全部轉錄本(U-1和U-2)相比，盡管有統計學意義，但推測U-1可能起著較為重要的作用。當然，從表達量比較，由于U-1表達顯著高于U-2，可能掩蓋了U-2的真實作用。因此，下一步我們將深入挖掘U-2 的生理學功能及調控機制。

綜上所述，本研究利用RNAi技術成功降低了UBE2A全部轉錄本(包括U-1和U-2)在HeLa細胞中的表達，并由此顯著提高HeLa細胞對順鉑細胞毒性的敏感性，提示UBE2A可能參與了順鉑誘導的細胞應激反應。本研究充實了UBE2A基因的功能研究，為改善順鉑的治療效果提供新的思路和靶點。