新疆塔城地區乳源酵母菌的分離、鑒定及其抗脅迫特性

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(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000;2.新疆西部牧業股份有限公司,新疆石河子 832000)

塔城地區位于亞歐大陸腹地,屬于中溫帶干旱和半干旱氣候區。這里世代居住著游牧民族,他們一直保留著以手工制作,運用傳統方法制做奶酪的工藝,使得新疆傳統發酵奶酪具有很鮮明的地域特色[1]。新疆傳統發酵奶酪中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、微量礦物質元素營養成分及生物活性成分[2-3]。

在奶酪的自然發酵過程中,酵母菌在奶酪成熟過程中起到至關重要的作用[4]。酵母菌作為發酵菌群的一部分,在乳酸鹽的同化、堿性代謝物的生成、細菌生長因子的釋放、乳糖的發酵、脂肪的分解、蛋白質水解、芳香化合物的形成等起著不可或缺的作用[5]。同時在自然發酵過程中,酵母常常會受到高溫條件[6-7]、高滲透壓條件[8]、高乙醇[9]含量等的影響,具有較好的耐受性得到廣泛關注。Techaparin等[10]在湄公河流域篩選出的釀酒酵母和畢赤酵母耐受43 ℃及13%酒精,乙醇生成濃度可達到89.32 g/L。Díaz-Nava等[11]篩選出畢赤酵母發酵力20 g/L糖濃度,能夠耐受高滲透壓脅迫,Qvirist[12]發現所篩選的馬克思克魯維酵母和畢赤酵母能耐受高溫和低pH,Koutinas等[13]將耐高溫畢赤酵母菌用以發酵果皮。

近年來，工業化發酵乳制品的生產、消費逐漸向牧區滲透,部分牧民已開始放棄傳統發酵乳制品的生產工藝和方法,導致發酵乳制品的產品種類、風味和菌種呈現單一化趨勢[14],不利于我國乳制品多樣化發展。本實驗以新疆塔城牧民自產的傳統奶酪為原料,采用形態學、生理生化特征、5.8S rDNA序列同源性分析相結合的方法對所篩酵母菌的歸屬進行了鑒定,并考察了耐酸、耐膽鹽、耐高溫、耐滲透壓、耐高溫等條件下存活能力。本實驗篩選能夠在人體環境下存活并且耐受能力良好的菌株,通過收集和保護新疆特色酵母菌資源,為新疆乳品多元化發展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆哈薩克族自制奶酪 新疆塔城地區牧場;酵母菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技有限公司;2x Taq PCR MasterMIX 天根生化科技有限公司:引物ITS 1與ITS 4 上海生工生物工程有限公司;脫脂乳粉培養基 脫脂乳粉12 g,水100 mL;麥芽培養基 麥芽浸粉130 g,水1000 mL;酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(Yeast extract peptone dextrose medium,YEPD) 蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,酵母浸粉5 g。

W-CJ-1Cg超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DNP-9272電熱恒溫培養箱 上海精宏試驗設備公司;5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;TC-512聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增儀 美國Techne公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 取1 g奶酪樣品,溶于150 mL脫脂乳粉液體培養基中,采取稀釋涂布平板法涂于麥芽培養基中進行分離,平板置于28 ℃培養箱中培養48 h,觀察并記錄菌落特征,挑選出不同形態的單一菌落,進行革蘭氏染色,觀察細胞形態,重復幾次純化酵母菌,直到鏡檢結果為同一細胞形態后,將其接種于YEPD固體斜面培養基上,28 ℃培養48 h后,于4 ℃保藏備用。

1.2.2 酵母菌的生理生化特性鑒定 酵母菌分離菌株主要通過繁殖方式觀察、糖發酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗等生理生化特征進行實驗[15]。

1.2.3 酵母菌的5.8S rDNA分析

1.2.3.1 酵母菌基因組DNA的提取 將1.2.1中純化的酵母菌接種于YEPD液體培養基中置于28 ℃培養36 h后,取1 mL活化菌液4 ℃下12000 r/min離心1 min,收集沉淀即為菌體。按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書上的方法進行操作,然后將所提取的DNA于-20 ℃保存。

1.2.3.2 5.8S rDNA PCR擴增 將1.2.3.1中制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板,使用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對5.8S-ITS區域酵母菌DNA進行擴增;采用50 μL反應體系:DNA模板2 μL,ITS 1(10 μmol/L)2 μL,ITS 4(10 μmol/L)2 μL,2xTaq PCR MasterMix 25 μL,加ddH2O補至50 μL。

1.2.3.3 擴增產物測序及系統發育分析 PCR產物經電泳檢驗合格后,將擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測得序列在美國國家生物技術信息中心(National center for biotechnology information,NCBI),利用BLAST軟件在GenBank核算序列數據庫中進行相似序列搜索,比較測序菌株與已知酵母菌相應序列的同源性[16]。

1.2.4 試驗酵母菌的選擇 取活化36 h的酵母菌株200 mL分別接種于含量有0.3%(v/v)豬膽鹽和pH2.0的YEPD液體培養基,置于28 ℃,150 r/min有氧培養,培養3 h后取出樣品,適當稀釋涂布于YEPD瓊脂平板上,在28 ℃下培養48 h后計數,得到菌落數(Colony forming units,CFU)。根據存活率選出對膽鹽和低pH具有強、中耐受性的菌株。

1.2.5 試驗酵母菌的活化 將1.2.1中保藏備用的菌種接種于YEPD液體培養基中,于28 ℃,150 r/min有氧培養24 h,對試驗酵母菌活化備用。

1.2.6 不同膽鹽濃度對試驗酵母菌生長曲線的影響 酵母菌株在YEPD液體培養基中28 ℃培養到OD600為1.0,離心收集細胞(6000 r/min 2 min,4 ℃),以磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH6.0)清洗兩次,然后將細胞置于膽鹽質量分數為0.2%、0.3%、0.4%的YPED液體培養基三角瓶中,置于28 ℃,150 r/min有氧培養48 h。在前24 h,每3 h取樣一次,在后24 h,每6 h取樣一次。測定樣品的OD600。以時間為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.2.7 試驗酵母菌體外脅迫特性研究

1.2.7.1 耐高溫試驗 將1.2.5中活化好的菌種接種于YEPD液體培養基中,接種量為4%(v/v)。分別在28、37、42 ℃下培養48 h,進行菌落計數[17],與空白對照組(培養溫度為28 ℃)對比,觀察其耐受性。

1.2.7.2 耐滲透壓試驗 將活化好的菌種接種于添加氯化鈉的YEPD液體培養基中,添加氯化鈉的質量分數分別為0(空白組)、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%的YEPD液體培養基中,接種量為4%(v/v)。在28 ℃下培養48 h后,進行菌落計數[17],觀察其耐受性。將活化好的菌種接種于添加葡萄糖的YEPD液體培養基中,葡萄糖的添加量為0(空白組)、10、20、30、40、50 g/100 g的液體YEPD培養基中,接種量為4%。在28 ℃下培養48 h后,進行菌落計數[17],觀察其耐受性。

1.2.7.3 乙醇耐受試驗 將活化好的菌種接種于添加無水乙醇的YEPD液體培養基中,添加無水乙醇的體積分數為0(空白組)、4%、8%、12%、16%、20%的液體YEPD培養基中,接種量為4%(v/v)。在28 ℃下培養48 h后,進行菌落計數[17],觀察其耐受性。

1.3 數據處理

本實驗實驗數據處理采用SPSS 19.0版本,采用MAGE 5.0和Origin 7.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離純化與鑒定

酵母菌在YEPD固體培養基分離純化后,共分離出34株酵母菌,酵母菌菌落形態結果如表1所示,細胞形態及繁殖方式如表2所示,理化鑒定結果如表3所示,碳源、氮源同化鑒定結果如表4所示。采用結合傳統形態學、生理生化特性方法對酵母菌進行鑒定,依據《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《食品微生物實驗技術》[18-21],鑒定結果為:A2-1、A2-4、A2-11、A3-2、A3-6、A4-4、A4-5、A4-6、A5-2、A5-13、A7-5、A7-6、和W7-3為畢赤酵母屬(Pichia);A2-6、A3-3、A6-3、W6-2、H7-4為有孢圓酵母屬(Torulaspora);部分菌株僅僅依據生理生化結果無法做出判斷。

表1 酵母菌的菌落形態結果Table 1 Results of yeast colony morphology

續表

表2 酵母菌細胞形態和繁殖方式Table 2 Yeast cell morphology and reproductive modes

表3 酵母菌的理化性質鑒定結果Table 3 Identification results of physiological and biochemical properties of yeasts

表4 碳源、氮源同化鑒定結果Table 4 Identification results of carbon assimilationand nitrogen assimilation experiment

2.2 酵母菌系統發育分析

34株酵母菌ITS分子生物學鑒定結果如表5所示。從表5中可以看出,34株酵母菌共被鑒定屬于6屬7種,其中庫德畢赤酵母為樣品中優勢菌種,占比為47.05%;較多的還有戴爾有孢圓酵母和美極梅奇酵母。將全部菌種序列數據號在NCBI中進行比對,構建系統發育樹,如圖1所示。

圖1 34株酵母菌的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 34 yeast strains

表5 34株酵母菌ITS鑒定結果Table 5 Identification results of ITS sequence of 34 yeast strains

圖1可知。菌株A2-13、A6-6、A4-3和W4-6與標準菌株同源性相似率低于99%,不能為同一種[17],結合生理生化鑒定結果,可以判定菌株A2-13和A6-6為馬克思克魯維酵母菌,菌株A4-3和W4-6為乳酸克魯維酵母。其余酵母菌同源性均在99%以上,表示其具有較近的親緣性。王文磊等[22]從蒙古奶酪中分離出株釀酒酵母,3株馬克斯克魯維酵母,2株班圖酒香酵母,3株膜醭畢赤氏酵母。李艷等[23]從內蒙古牧區分理出馬克思克魯維酵母菌、隱球酵母菌、釀酒酵母菌、熱帶假絲酵母菌、陸生伊薩酵母菌和季也蒙畢赤酵母菌。由此看來,本研究分離的酵母菌具有不同的菌種種類,可能與當地的地理位置、外部環境有關[24]。從34株酵母菌中挑選出生長旺盛、生理生化特性比較典型的7株酵母菌(A1-2、A2-1、H2-3、A2-6、H2-6、A2-13、A4-3)進行下一步實驗。

2.3 耐酸耐膽鹽酵母菌的篩選

酵母菌存活率如圖2所示。從圖2中可以看出，所有菌株中,A2-1菌株和H2-3菌株在0.3%豬膽鹽存活率最高,H2-6菌株和A4-3菌株在pH2.0條件下存活率最高,但菌株H2-3和W2-3在低pH條件下無法存活。為了挑選出對低pH和耐膽鹽具有良好耐受性的菌株進行后續實驗,所以選擇了A2-1和A2-13作為下一步試驗菌株。

圖2 7株酵母菌耐酸耐膽鹽存活率Fig.2 Acid and bile salt survival rate of 7 yeast strains

2.4 試驗酵母菌耐膽鹽生長曲線

酵母菌在不同膽鹽濃度中生長情況,結果如圖3所示。從圖3中可以看出,膽鹽濃度會對菌株生長產生明顯的抑制作用。在加入膽鹽后,會對2株菌株均會產生一定時間的遲滯期,但受影響的程度不同,其中菌株A2-13遲滯期更加明顯。當膽鹽濃度為0.4%時,菌株A2-13的生長受到嚴重抑制,相對于菌株A2-1,菌株A2-13耐膽鹽的能力較弱。

圖3 膽鹽濃度對兩株酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of bile salt on growth of 2 yeast strains

2.5 試驗酵母菌體外脅迫特性研究

2.5.1 耐高溫試驗 酵母菌在不同溫度條件下生長情況結果見圖4。從圖4中可以看出,兩株菌在28 ℃(CK組)時生長情況優于37 ℃,但兩株菌在42 ℃高溫條件下良好生長。菌株A2-1比A2-13更不耐高溫,隨著溫度升高,死亡率升高(p<0.05)。上述結果表明,不同屬酵母菌之間耐高溫的能力不同。A2-13菌株比劉超帝[25]、卜文靜[26]、譚才鄧[27]、石嬌嬌[28]等篩選耐高溫酵母菌更能耐高溫,其相較A2-1更具有應用于生產、解決現實生產存在問題的價值。

圖4 菌株對不同溫度耐受比較Fig.4 Tolerance to different temperatures for yeast strains注:A、B、C和a、b、c、e表示標有不同字母的組分間有顯著性差異,p<0.05。

2.5.2 耐滲透壓試驗

2.5.2.1 耐鹽試驗 酵母菌在不同鹽濃度條件下的生長情況結果見圖5。由圖5可知,隨著NaCl濃度的增加,兩株酵母菌的生長情況出現下降,受到明顯抑制(p<0.05),但NaCl濃度由0.8%增加到1.2%時兩株酵母菌生長發育沒有受到明顯抑制(p<0.05),當達到1.6%NaCl濃度時,菌株A2-1受到明顯抑制,而菌株A2-13表現出更好的耐鹽性能,在2.4%NaCl濃度的情況下,菌落總數依然能保持在108個,具有很好的耐高鹽潛力。與烏日娜等[29]、柴洋洋等[30]的研究結果相比,相同鹽濃度水平表現相當,但當鹽濃度大于2.4%時,兩人所篩選菌株強于A2-1和A2-13。

圖5 菌株對不同濃度氯化鈉耐受比較Fig.5 Tolerance to different concentrations of NaCl for yeast strains注:A、B、C、D和a、b、c、d、e表示標有不同字母的 組分間有顯著性差異,p<0.05。

2.5.2.2 耐糖試驗 酵母菌在不同糖濃度條件下的生長情況結果見圖6。由圖6可知,隨著糖濃度的不斷增加,兩株菌的數量逐漸減少,與耐鹽實驗基本吻合,且菌株A2-13的耐高糖能力優于菌株A2-1。在糖濃度為10%～30%情況下,菌株A2-13沒有顯現出更進一步受到抑制(p>0.05),當糖濃度增加至40%時,表現出明顯的抑制作用(p<0.05)。與賈春鳳等[31]、蘭釗等[32]所篩選的耐高糖酵母菌相比,菌株A2-1和A2-13耐高糖能力優良,在糖濃度為50 g/100 g時，依舊能達到3.63×106和2.51×107CFU/mL。

圖6 菌株對不同含量葡萄糖耐受比較Fig.6 Tolerance to different concentrations of glucose for yeast strains注:A、B、C、D、E、F和a、b、c、d、e表示標有不同字母的 組分間有顯著性差異,p<0.05。

2.5.3 耐乙醇試驗 酵母菌在不同乙醇濃度條件下的生長情況結果見圖7。由圖7可知,乙醇含量逐漸增加,兩株酵母菌的細胞數逐漸降低,酵母菌的生長、發育與繁殖受到顯著的影響(p<0.05),菌株A2-1在乙醇含量達到16%時無法生存,而菌株A2-13雖然明顯被抑制,但是細胞總數能達到105個,乙醇耐受性能優于菌株A2-1。當培養基中乙醇含量高達20%時,兩株酵母菌完全受到乙醇的抑制作用,無法生存。A2-13能在16%乙醇含量條件下能夠達到2.00×105CFU/mL,與隋玉潔等[33]、賴穎等[34]研究相比,與其所篩耐乙醇酵母菌耐乙醇能力相當,A2-1耐乙醇能力相較較弱。

圖7 菌株對不同濃度乙醇耐受比較Fig.7 Tolerance to different concentrations of alcohol for yeast strains注:A、B、C、D、E、F和a、b、c、d、e、f表示標有不同字母的組分間有顯著性差異,p<0.05。

3 結論

本實驗對新疆塔城地區8個牧場采集的奶酪樣品中分離出34株酵母菌,利用傳統形態學、生理生化特征方法、分子生物學鑒定,篩選出共6屬7種酵母菌,分別被鑒定為庫德畢赤酵母菌(47.05%)、戴爾有孢圓酵母(17.65%)、美極梅奇酵母菌(11.76%)、馬克思克魯維酵母(5.88%)、釀酒酵母(5.88%)、膠紅酵母(5.88%)、乳酸克魯維酵母(5.88%),其中庫德畢赤酵母菌為優勢菌株。

在耐受性脅迫實驗中,庫德畢赤酵母菌A2-1能夠耐受42 ℃高溫、2.4%高鹽脅迫、50 g/100 g高糖脅迫以及12%酒精脅迫;馬克思克魯維酵母菌A2-13能夠耐受42 ℃高溫,2.4%高鹽脅迫、50 g/100 g高糖脅迫以及16%酒精脅迫。兩株菌耐受能力良好,可以在人體環境下存活,而對高溫、高滲透、高乙醇脅迫,兩株酵母菌都表現出較好的耐受能力。對兩株耐脅迫菌株的研究,收集和保護了新疆特色酵母菌資源,為新疆乳品多元化發展提供支持。