蒲公英甾醇通過ROS/ERK/iNOS途徑保護Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的實驗研究

陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

幽門螺旋桿菌相關性胃炎是指與幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染相關的胃黏膜急慢性炎癥或萎縮性病變[1]。Hp感染后可激發機體發生氧化應激(reactive oxygen species，ROS)反應，生成的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、超氧化物(Superoxide，O2-)等產物是造成胃黏膜損傷，導致胃炎發生的重要因素[2-3]。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的，其中由iNOS活化后產生的過量NO發揮有害效應。因此iNOS表達量是NO異常產生的關鍵[4]。ERK是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中成員之一。它磷酸化后激活，激活的ERK1/2介導多種生物學反應[5-6]。大量研究證明，ROS是導致ERK1/2磷酸化的重要激活劑[7]，而ERK1/2激活后又加劇了ROS對胃黏膜的損傷，抑制了胃黏膜的修復，引起急慢性胃炎，甚至出現細胞的過度增值分化[8]。蒲公英作為傳統的中草藥具有廣泛的藥理活性[9]，研究表明，蒲公英甾醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[10]。本實驗中蒲公英甾醇通過ROS/ERK/iNOS途徑減輕HP相關性胃炎大鼠胃黏膜的氧化損傷，保護胃黏膜。為中草藥蒲公英資源的有效開發和合理應用提供了實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 動物 成年雄性清潔級SD大鼠(220-240g)48只，購自西安交通大學實驗動物中心，許可證號:SCXK (陜) 2012-003。實驗室飼養溫度(20±2)℃，所有動物適應性喂養1周。

1.2 藥品與試劑 快速尿素酶試驗試劑盒(安信生物技術有限公司)，蒲公英甾醇純度≥98%(成都瑞芬思生物科技有限公司)，抗體：iNOS (sc-5302)、NOX2 (sc-20782)、ph-ERK1/2(sc-16982)、NOX4 (sc-21860)、SOD (sc-17767)。

1.3 儀器 DXM1200F光學顯微鏡(尼康)，TS100倒置顯微鏡(尼康)，KD2800低溫恒冷切片機，GENIUS 16K臺式高速離心機，TP1020脫水機，ZMN200烘片機，5010 型石蠟切片染色機，微波爐，高壓鍋，恒溫水浴箱，WB機(Bio-Rad, USA)。

2 方法

2.1 造模 48只大鼠隨機分成正常組、正常+蒲公英甾醇組、模型組、模型+蒲公英甾醇組，每組各12只。參考文獻[11]對模型組及模型+蒲公英甾醇組大鼠進行造模。造模大鼠禁食12 h后用NaHCO3+消炎痛溶液0.5 mL/只進行灌胃，然后禁食6 h，以HP菌液(含量109/mL)1.5 mL/只灌胃，再禁食、禁水4 h，隔天1次,連續10 d，正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠常規喂養。4周后，每組隨機處死2只大鼠，取出鼠胃并沿胃大彎剪開,取一半胃黏膜組織做快速尿素酶實驗、黏膜涂片革蘭染色，以判斷胃竇黏膜HP定植情況；取另一半胃黏膜組織,用4%多聚甲醛固定24 h后進行病理組織學檢查。造模組大鼠胃竇黏膜變薄，有中度慢性活動性炎癥和中度萎縮，上皮糜爛，固有層充血，中性粒細胞和淋巴細胞浸潤等不同程度炎性改變，正常組的大鼠胃黏膜切片未見胃炎的病理改變。

2.2 給藥 正常+蒲公英甾醇組與模型+蒲公英甾醇組大鼠按10 mg/kg·d蒲公英甾醇，正常組和模型組用等體積生理鹽水于每天上午9～10時灌胃，連續給藥4周。

2.3 Western Blot檢測 取胃組織勻漿后測定蛋白含量，制備SDS-PAGE膠，蛋白變性、上樣、電泳、轉膜、封閉加一抗過夜，TBST洗膜，二抗封閉，TBST洗膜，發光。分別測定ph-ERK1/2、iNOS、NOX2、NOX4、SOD蛋白的含量。以β-actin作為內參，使用Image J分析軟件，計算每一樣本蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 對Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2含量的影響 由表1、圖1可知，模型組大鼠NOX2的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的NOX2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠胃黏膜NOX2、NOX4、iNOS、SOD、t-ERK、ph-ERK蛋白的表達 (%,±s)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.2 對Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的NOX4含量的影響 由表1、圖2可知，模型組大鼠NOX4的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組NOX4含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

3.3 對Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜iNOS含量的影響 由表1、圖3可知，模型組大鼠iNOS的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的iNOS含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間無統計學差異(P>0.05)。

3.4 對Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜SOD含量的影響 由表1、圖4可知，模型組大鼠SOD的含量明顯低于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的SOD含量明顯高于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

3.5 對Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的ph-ERK1/2、t-ERK1/2含量的影響 由表1、圖5可知，模型組大鼠ph-ERK1/2的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的ph-ERK1/2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間無統計學差異(P>0.05)，各組間t-ERK1/2的含量差異無統計學意義(P>0.05)。

4 討論

幽門螺旋桿菌(Hp)是最常見的傳染性病原菌之一，全球有超過50%的人群感染,我國的平均感染率高達56%[12]。研究表明，在Hp引起的胃黏膜損傷中，氧化應激起了十分重要的作用，首先，氧自由基可形成大量的脂質過氧化物，損傷細胞內線粒體和溶酶體，引起胃黏膜血流障礙，導致黏膜損傷。其次，氧自由基也可破壞上皮間質透明質酸酶和膠原纖維網而引起胃黏膜的進一步損害[8]。NADPH氧化酶是消化道黏膜ROS的重要來源，它的激活是組織內活性氧簇產生的重要原因之一，NADPH氧化酶(NOX)家族有7個成員(NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1，DUOX2)，在消化道中存在的NOX家族成員主要是NOX2和NOX4。它們是消化系統疾病中ROS產生的主要來源[13]。當Hp進入機體后被中性粒細胞迅速吞噬，形成吞噬體，通過NAD(P)H氧化酶系統，增加過氧化物、一氧化氮等產物的產生，致使胃黏膜受損。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物體內氧自由基清除的首要防線，它可降低氧化應激對細胞膜的損害并且能夠修復受損的細胞，起到保護胃黏膜的作用[14]。

iNOS是誘導型一氧化合酶(NOS)，可在內毒素、脂多糖、ROS等多種外界因素的刺激下被激活，生成大量的NO，而高濃度的NO對胃黏膜細胞有毒性作用，引起胃黏膜的損傷[4]。ERK是將細胞外信號轉導到細胞內部的重要物質，已有研究證明，ERK通路活性增高不僅可促進胃黏膜細胞的增殖，而且該通路的激活對于胃黏膜的損傷也具有重要意義[7]。Hp定植胃黏膜后，胃黏膜ROS明顯增加，引發胃黏膜血流障礙，導致胃黏膜損傷。同時ERK通路被激活，從而使細胞外信號轉導到細胞內，促進多種核內轉錄因子磷酸化，調控基因表達，加劇胃黏膜的損傷，抑制胃黏膜的修復，引起急慢性胃炎，甚至出現細胞的過度增值分化。

目前現代醫學對Hp感染的標準三聯療法面臨著Hp對抗生素的耐藥問題,而耐藥性是導致Hp根除失敗的主要原因。蒲公英作為傳統的中草藥其主要活性成分蒲公英甾醇被證明具有抗氧化、抗炎的重要藥理作用，而被臨床上廣泛應用。本試驗結果表明，蒲公英甾醇能夠明顯減少Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2、NOX4、iNOS和ph-ERK1/2的表達，增加SOD的表達，因此我們認為蒲公英甾醇可通過ROS/ERK/iNOS途徑減輕Hp相關性胃炎大鼠胃黏膜的氧化損傷，保護胃黏膜。這為其作為該疾病的防治藥物提供了新的理論和實驗依據。